李文淼

摘 要：用PCR方法擴增新城疫病毒（NDV）的M基因片段，構建含有M基因片段的重組質粒，以不同濃度的NDV-M基因重組質粒為模板，用SYBR Green I方法來建立檢測NDV載量的熒光定量PCR方法。用該方法對A、B兩個廠家的新城疫弱毒疫苗的NDV載量進行了比較檢測，結果發(fā)現(xiàn)A廠家生產的疫苗的NDV載量極顯著高于B廠家生產的疫苗。

關鍵詞：新城疫;熒光定量PCR

一、材料

1.ND疫苗

本試驗選用2種雞新城疫疫苗為：

疫苗A：雞新城疫活疫苗（Clone 30株）;A廠家。

疫苗B：雞新城疫活疫苗（VG/GA株）;B廠家。

2.試劑

酶類：Taq DNA聚合酶。

載體及菌株：載體pUC-T和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。

試劑盒：RNA提取試劑盒和DNA片段快速膠回收試劑盒;2×SYBR? Green Realtime PCR Master Mix;高純度質粒小提中量試劑盒。

3.培養(yǎng)基及相關試劑配制

氨芐青霉素（Amp）貯存液、20mg/mL X-gal貯存液、200mg/mL IPTG 貯存液、LB培養(yǎng)基、LB/Amp+液體培養(yǎng)基、LB/Amp+固體培養(yǎng)基、LB/Amp+/X-gal/IPTG平板等。

4.瓊脂糖凝膠電泳所用溶液

10 mg/mL GoldView、50× TAE電泳緩沖液、1×TAE電泳緩沖液、1.5%瓊脂糖凝膠等。

5.主要儀器設備

MJ-PCR儀、PAC3000型電泳儀、DYYⅢ-31A/31B型電泳槽、DYYⅢ-2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 、Alpha ImagBrTM2200型凝膠成像分析系統(tǒng)、YJ-875SA醫(yī)用凈化工作臺等。

二、方法

1.病毒RNA的提取

用滅菌PBS溶解ND弱毒疫苗，按照每1000頭份/5 mL PBS溶解，取250 μL溶液，按照RNA提取試劑盒使用說明書，提取病毒RNA，用100 μL TE緩沖液溶解，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.反轉錄-PCR擴增

上游引物NDVU：5?-ACTTGTGGACTGATAGTAAGGAGGA -3?，下游引物NDVD：5?-GCATTCA CTG ATGAGTATTTGTTTG -3?，預期擴增片段長度為319 bp。

3.PCR產物的克隆

PCR產物回收：將PCR擴增產物進行電泳觀察，切下特異性目的條帶，進行回收、洗脫備用。

PCR產物的克隆：對pUC-T載體和純化回收后的PCR產物進行連接。

4.重組質粒的鑒定

重組質粒DNA的小量制備：將白斑接種3mL LB/ Amp+液體培養(yǎng)基，37℃ 振蕩培養(yǎng)15 h;取1.5mL菌液，提取重組質粒DNA，洗脫、冷凍、保存。

重組質粒PCR鑒定：將質粒作50× 稀釋，取1 L作模板進行PCR擴增，若擴增出預期目的片段，則視為NDV-M基因的陽性重組質粒。

序列測定與分析：挑取陽性重組質粒，進行測序。比對分析后，確定是否為NDV-M基因序列。

5.Real-time PCR標準曲線的建立

（1） 標準曲線的建立。將NDV-M基因重組質粒用滅菌TE溶液作10倍系列稀釋，用不同稀釋梯度的NDV-M基因重組質粒作為模板，使用SYBR Green方法進行Real-time PCR擴增。熒光定量PCR儀將會自動生成擴增曲線與熔解曲線。計算兩兩相鄰濃度的NDV-M基因重組質粒模板的Ct值的差值，選用變異度小于10%的濃度質粒模板來繪制標準曲線圖。

（2）特異性試驗。用建立NDV-M基因標準曲線的條件擴增NDV Lasota株、NDV Clone-30株等核酸模板，以評價所建立的熒光定量PCR 方法的特異性。

（3）敏感性試驗。選取4個10倍系列稀釋的低濃度的NDV-M基因重組質粒，進行熒光定量PCR和常規(guī)PCR擴增，比較確定兩種方法能檢測到的最低濃度。

（4）重復性試驗。將NDV-M基因重組質粒標準品置于-20 ℃保存，每隔7天取出1次，進行3次獨立檢測，每次每種質粒濃度均進行3次重復反應，計算Ct值的變異系數(shù)。

6.新城疫弱毒疫苗病毒載量的檢測

從兩種疫苗的250 μL溶液中提取病毒RNA，用100 μL TE緩沖液溶解，取7 μL 進行反轉錄合成20 μL cDNA，取5 μL cDNA用建立的NDV real-time PCR進行檢測，比較分析兩個廠家ND疫苗病毒載量的差異。

三、結果與分析

ND弱毒疫苗的檢測

提取北京大興區(qū)使用較廣泛的2種商品ND弱毒活疫苗RNA，反轉錄成cDNA后分別用常規(guī)PCR和熒光定量PCR方法進行比較檢測。擴增曲線和熔解曲線結果顯示，A廠家生產的ND疫苗的Ct值小于B廠家。

四、 討 論

熒光定量PCR技術，能夠克服常規(guī)PCR技術所存在的假陽性較多和敏感性不夠的不足。

用此技術對北京大興地區(qū)使用較為廣泛的2種ND弱毒活疫苗進行NDV核酸載量檢測。結果發(fā)現(xiàn)，A廠家明顯高于B廠家。兩種疫苗病毒載量的明顯差異，可能是兩種疫苗免疫效果差異的主要原因。

五、小結

用建立的NDV SYBR GreenⅠreal-time PCR方法對數(shù)種商品ND弱毒活疫苗的病毒載量進行了比較檢測，結果顯示，B廠家生產的ND疫苗（VG/GA株）病毒載量極顯著低于A廠家生產的ND疫苗（Clone 30株）。

六、結語

A廠家生產的ND疫苗（Clone 30株）的病毒載量極顯著高于B廠家的ND疫苗（VG/GA株）。

參考文獻：

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