劉若男 朱黎 劉堂榮 鄒旋 許哲 管華詩

摘 要：利用酶催化反應(yīng)，結(jié)合在線SPE/液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)，建立了一種通過定量酶反應(yīng)過程測定生物效價(jià)的分析方法，用于評價(jià)肝素類藥物抗IIa因子效價(jià)和抗Xa因子效價(jià)。本方法采用在線C18柱富集純化樣品后，在另一根C18柱上，以水乙腈體系為流動(dòng)相進(jìn)行分離，并采用電噴霧正離子模式，以多反應(yīng)檢測（MRM）方式進(jìn)行定量分析。方法學(xué)考察結(jié)果表明，酶反應(yīng)產(chǎn)物對硝基苯胺（pNA）在3～1000 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法的定量限為3 μg/L，準(zhǔn)確度（相對回收率）為88.8%～100.6%，日內(nèi)與日間精密度（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差）分別為1.1%～5.4%（n=6）和3.8%～10.9%（n=18），無明顯基質(zhì)效應(yīng)。以肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品為對照品，測定了2個(gè)肝素鈉供試品的生物效價(jià)，均達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)要求。本方法較紫外分光光度法具有更好的靈敏度和良好的重現(xiàn)性，酶試劑及底物用量更少，可作為測定肝素類藥物生物效價(jià)的新方法，為肝素類藥物生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：質(zhì)譜; 生物效價(jià); 肝素; 在線固相萃取; 高效液相色譜

1 引 言

肝素（Heparin，HP）為硫酸糖胺聚糖類天然抗凝劑，具有預(yù)防血栓形成的作用[1]。盡管肝素在皮下給藥后能快速抗凝，而且相對便宜，但由于治療窗窄、長期使用產(chǎn)生血小板減少癥等限制，使得HP臨床使用時(shí)必須依據(jù)患者的凝血功能指導(dǎo)用藥[2]。雖然研究者已深入探究了肝素結(jié)構(gòu)和生物活性的關(guān)系[3～5]，但由于肝素抗凝活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)尚未完全揭示，因此，生物效價(jià)的測定成為肝素類藥物質(zhì)量評估的重要指標(biāo)，用于反映肝素類藥物的抗凝活性[6]。目前，肝素活性主要通過測定活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、激活凝血時(shí)間（ACT）和凝血酶原時(shí)間/國際標(biāo)準(zhǔn)化比率（PT/INR）等指標(biāo)反映[7]。這些傳統(tǒng)的抗凝活性測定方法靈敏度較低，儀器、試劑和操作人員的變化都會對結(jié)果產(chǎn)生影響。相較于傳統(tǒng)凝血測試，血栓彈力圖（TEG）[8，9]和凝血活酶生成測定（TGT）[10]在監(jiān)測肝素活性時(shí)靈敏度更高。目前，TEG各監(jiān)測指標(biāo)的參考值尚未完全統(tǒng)一，儀器之間的差距較大，需要針對不同分析儀設(shè)定基線值[11]。TGT測定則缺乏標(biāo)準(zhǔn)化操作流程和評估指南。血栓形成測試以血塊生長速率表征凝血程度，為抗凝檢測提供了標(biāo)準(zhǔn)化的測試方法[12]。以上這些方法均需要使用血漿等可能引入誤差的生物制品，給出的是多種抗凝反應(yīng)的綜合結(jié)果，無法對實(shí)際造成凝血障礙和出血副作用的主要病理機(jī)制進(jìn)行確認(rèn)[13]。近年來，一些醫(yī)療機(jī)構(gòu)嘗試通過測定單個(gè)凝血因子的抗凝活性監(jiān)測肝素類藥物用藥[14，15]?，F(xiàn)行2015版《中國藥典》二部中肝素鈉的效價(jià)測定采用紫外可見分光光度法，針對單一凝血因子效價(jià)（抗IIa因子和抗Xa因子效價(jià)）進(jìn)行分別測定[16]。藥典方法需要使用大量價(jià)格昂貴的試劑，如各類酶制劑，導(dǎo)致測試成本較高。此外，樣品基質(zhì)的干擾對該方法的結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大。鑒于此，有研究者采用熒光法取代紫外法[17，18]， 提高了檢測靈敏度，避免了樣品背景的干擾，但在高濃度時(shí)，無法避免自身熒光的影響。

測定效價(jià)過程用到的試劑較多，成分復(fù)雜，為了排除背景基質(zhì)的干擾，可以通過引入各種分離技術(shù)進(jìn)行效價(jià)測定，如體積排阻色譜等[19]。但是，進(jìn)行色譜分析前必需進(jìn)行必要的樣品前處理操作，從復(fù)雜樣品基質(zhì)中提取、凈化、分離和富集目標(biāo)物，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，防止污染分析儀器。傳統(tǒng)的樣品前處理方法多采用離線方式，如液液萃取、固相萃?。⊿PE）、QuEChERs法等，大多步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，溶劑消耗大。在線固相萃取是類似于二維液相色譜的樣品前處理方法，通過柱切換分別進(jìn)行樣品純化和分離分析，實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)前處理，減少了分析時(shí)間及溶劑消耗，并避免人為因素引起的誤差，有效提高了檢測的準(zhǔn)確性。在線SPE/液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)一般包括兩個(gè)獨(dú)立的色譜泵，6位/10位柱切換閥及在線SPE柱和分析柱。近來，在線固相萃取技術(shù)在生物醫(yī)藥、食品和環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用已多有報(bào)道[20～24]。

肝素主要的抗凝作用是通過增強(qiáng)抗凝血酶III（AT Ⅲ）這類絲氨酸蛋白酶抑制劑的活性以及酶抑制劑復(fù)合物的穩(wěn)定性而實(shí)現(xiàn)的。肝素糖鏈與AT Ⅲ的結(jié)合會引起AT Ⅲ局部構(gòu)象發(fā)生改變，從而與凝血因子特別是凝血酶（IIa因子，F(xiàn)IIa）和凝血因子Xa（Xa因子，F(xiàn)Xa）結(jié)合，形成HPATIIIIIa因子及HPATIIIXa因子三元復(fù)合物，抑制凝血因子的功能，起到抗凝的效果。此時(shí)，游離的IIa因子和Xa因子仍具有活性，可以水解其相應(yīng)的特異底物[25]。本研究利用在線SPE/液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)，通過定量IIa因子和Xa因子參與催化的酶反應(yīng)過程測定生物效價(jià)，不需要使用血漿等生物制品，符合國際上盡可能用理化分析方法代替生物測定的趨勢。本方法可用于肝素類藥物抗IIa因子效價(jià)和抗Xa因子效價(jià)的檢定，為生產(chǎn)和臨床使用中肝素的質(zhì)量評估提供了新方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

1290 Infinity Value Drive（G1170）二位十通閥、1260 Infinity II泵和1290 Infinity II6460 Triple Quad UHPLC/MS 高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）; Spectra MAX190 型酶標(biāo)儀（美國 Molecular Devices 公司）; Thermo Micro 21R低溫超速離心機(jī)（美國Thermo公司）; HWS12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）; 十萬分之一天平（梅特勒托利多集團(tuán)）; pH 4000 基礎(chǔ)酸度計(jì)（上海安萊立斯儀器科技有限公司）; 渦旋混合器（德國艾卡公司）。

IIa因子（EC 3.4.21.5; 5 IU/mg）、Xa因子（EC 3.4.21.6; 0.25 IU/mg）、抗凝血酶III（1 IU/mg）、顯色底物S2238和S2765（北京艾德豪克國際科技有限公司）; 肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品： 批號150509200912，標(biāo)示效價(jià)為 197 IU/mg（中國食品藥品檢定研究院）; 肝素鈉供試品（東營天東生化工業(yè)有限公司）; 三羥甲基氨基甲烷（Tris）、對硝基苯胺（pNA）和N甲基對硝基苯胺（上海阿拉丁化學(xué)有限公司）; 甲酸（美國SigmaAldrich公司）; 乙腈、甲醇（LCMS級，德國Merck公司）; 雙蒸水（香港屈臣氏基團(tuán)有限公司）; 其它試劑均為分析純。

2.2 溶液配制

三羥甲基氨基甲烷聚乙二醇（PEG）6000緩沖溶液（pH 8.4）的配制： 分別稱取Tris 6.06 g，NaCl 10.23 g，乙二胺四乙酸二鈉 2.8 g，PEG 6000 1.0 g，加水溶解，以HCl調(diào)節(jié)至pH 8.4，加水定容至1000 mL。

肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品（S）溶液： 稱取肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品適量，按相鄰高濃度與低濃度的劑量比1∶0.5加入TrisPEG 6000緩沖溶液，分別配制0.04 IU/mL（S1）、0.02 IU/mL（S2）、0.01 IU/mL（S3）和0.005 IU/mL（S4）4個(gè)不同濃度的肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

肝素鈉供試品（T）溶液： 肝素鈉供試品預(yù)估效價(jià)為200 IU/mL，按與標(biāo)準(zhǔn)品溶液同樣的劑量比1∶0.5加TrisPEG 6000緩沖液，分別配制成0.04 IU/mL（T1）、0.02 IU/mL（T2）、0.01 IU/mL（T3）和0.005 IU/mL（T4）4個(gè)不同濃度的肝素鈉溶液。

酶溶液： 用TrisPEG 6000緩沖液配制酶溶液，抗凝血酶III、IIa因子、Xa因子的濃度分別為0.005、0.01和0.005 IU/mL。

底物溶液： 用水分別配制0.15 μmol/L的S2238和S2765溶液。

pNA儲備液： 稱取4.0 mg pNA標(biāo)準(zhǔn)品，用50%（V/V）乙腈溶液定容在100 mL棕色容量瓶中，于4℃保存，備用。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液： 準(zhǔn)確移取適量pNA儲備液，分別配制1、3、5、25、50、100、200、500和1000 μg/L的pNA溶液，各加入等體積的50 μg/L內(nèi)標(biāo)物（ISTD）N甲基4硝基苯胺，混勻備用。

pNA質(zhì)控樣品： 將上述pNA儲備液用水稀釋成相應(yīng)濃度，配制質(zhì)控樣品，用于方法學(xué)驗(yàn)證。質(zhì)控樣品包括低濃度質(zhì)控（5 μg/L）、 中濃度質(zhì)控（50 μg/L）和高濃度質(zhì)控（500 μg/L）樣品。

2.3 液相色譜質(zhì)譜方法

在線固相萃取與液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)如圖1所示。

在線固相萃取條件： ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（A， 12.5 mm×4.6 mm， 5 μm， 安捷倫公司），清洗流動(dòng)相對應(yīng)泵A流動(dòng)相，組成為0.5%甲酸乙腈（9∶1， V/V），等度洗脫，流速為0.6 mL/min。

色譜分離條件： Poroshell 120 EC C18色譜柱（B，50 mm×2.1 mm， 2.7 μm，安捷倫公司）為分析柱，流動(dòng)相為水乙腈（4∶6， V/V），等度洗脫1.8 min; 流速為0.4 mL/min; 進(jìn)樣量為2 μL; 柱溫35℃。

電噴霧質(zhì)譜（ESIMS）條件： 正離子模式; 碎裂電壓： 90 V; 干燥氣溫度： 350℃; 霧化器壓力： 2.76×104 Pa; 干燥氣流速： 10 L/min; 毛細(xì)管電壓： 4000 V; 采用多重離子監(jiān)測模式（MRM）進(jìn)行定量分析，pNA定量離子對： 母離子m/z 139.1，子離子m/z 122.0，碰撞能量（CE）為13 V; ISTD定量離子對： 母離子m/z 153.1，子離子m/z 136.0，碰撞能量（CE）12 V。

參照近年來在線樣品前處理技術(shù)報(bào)道[26～28]，本研究在一套商品化的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀基礎(chǔ)上，通過一個(gè)十通閥將另一個(gè)液相色譜泵與之相連，并配兩根色譜柱（色譜柱A和色譜柱B），實(shí)現(xiàn)對效價(jià)反應(yīng)體系樣品的在線固相萃取和分析，包括以下3個(gè)步驟： （1）裝載和清洗 六通閥（閥A）處于虛線連通位置，自動(dòng)進(jìn)樣器將待分析樣品注入閥A的定量環(huán)中; 然后閥A切換至實(shí)線位置，定量環(huán)中的樣品隨泵A流動(dòng)相流入色譜柱A（在線SPE柱）中，其中效價(jià)反應(yīng)體系中洗脫下來的蛋白和鹽類等物質(zhì)經(jīng)閥A最后進(jìn)入廢液，而pNA和內(nèi)標(biāo)物（ISTD）被保留在在線SPE柱中，清洗時(shí)間為1.2 min; （2）洗脫和分離 1.2 min后，切換閥A和閥B至虛線連通位置，色譜柱A和色譜柱B（分析柱）串聯(lián)連接，泵B流出的流動(dòng)相水乙腈（4∶6，V/V）以流速0.4 mL/min等度洗脫1.8 min。在線SPE柱上保留的目標(biāo)物pNA和內(nèi)標(biāo)物被洗脫到分析柱上并進(jìn)行分離和質(zhì)譜檢測; （3）平衡 待樣品分析完成后，閥A和閥B切換至實(shí)線位置， 系統(tǒng)平衡1 min，切換閥A重新至進(jìn)樣位置，則重新進(jìn)樣，依此循環(huán)至所有樣品分析完成。

2.4 肝素生物效價(jià)的測定

2.4.1 抗IIa因子 將肝素鈉、IIa因子溶液和底物（S2238）溶液提前孵育在37℃的水浴鍋中。參考藥典方法[16]，構(gòu)建抗IIa因子效價(jià)反應(yīng)體系。抗IIa因子效價(jià)反應(yīng)體系由肝素鈉、AT Ⅲ、FIIa以及底物S2238組成，在合適的條件下反應(yīng)生成pNA?？瞻卓笽Ia因子效價(jià)反應(yīng)體系指未加入底物S2238的上述化合物的混合物。取25 μL不同濃度的肝素標(biāo)準(zhǔn)品（S）和供試品（T），按照S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4的順序分別加入到96孔板中，然后依次在每孔中加入25 μL的AT Ⅲ，混勻后放置2 min。隨后每孔加入50 μL IIa因子，混勻后放置2 min，再加入50 μL S2238，混合振蕩。5 min后， 加入150 μL乙腈淬滅反應(yīng)，取出100 μL淬滅后的反應(yīng)液與100 μL內(nèi)標(biāo)物混合，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后直接進(jìn)行LCMS分析，計(jì)算pNA濃度。

2.4.2 抗Xa因子 抗Xa因子效價(jià)反應(yīng)體系由肝素鈉、ATⅢ、Xa因子以及底物S2765組成，在合適的條件下反應(yīng)生成pNA?？瞻卓筙a因子效價(jià)反應(yīng)體系指僅未加入底物S2765的上述化合物的混合物。步驟同2.4.1節(jié)所述，使用底物S2765和Xa因子分別代替抗IIa因子效價(jià)反應(yīng)體系中的底物S2238和酶IIa因子，建立抗Xa因子效價(jià)反應(yīng)。

2.4.3 計(jì)算方法與結(jié)果評定 使用肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品，按照生物檢定統(tǒng)計(jì)法（中國藥典2015年版第三部通則）[29]中的量反應(yīng)平行線原理4×4法，以pNA濃度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液（或供試品系列溶液）濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)， 分別做線性回歸，計(jì)算效價(jià)及實(shí)驗(yàn)誤差。可靠性檢測結(jié)果： 回歸應(yīng)p<0.01， 偏離平行應(yīng)p >0.05，二次曲線應(yīng)p >0.05，反二次曲線應(yīng)p >0.05，認(rèn)為結(jié)果可靠。可信限率（FL，%）反映檢定結(jié)果的精密度。對于供試品，要求按干燥品計(jì)算，1 mg抗IIa因子的效價(jià)不得低于180 IU，抗Xa因子效價(jià)與抗IIa因子的效價(jià)比應(yīng)為0.9～1.1。

3 結(jié)果與討論

3.1 在線前處理/液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法的建立

在線固相萃取系統(tǒng)的操作條件對樣品前處理的效果具有重要影響。為了保證在盡可能去除干擾的基礎(chǔ)上，獲得良好的分離度和峰形，首先對在線固相萃取系統(tǒng)的清洗流動(dòng)相組成、洗脫時(shí)間及流速等條件進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)過上樣步驟后，基質(zhì)和目標(biāo)化合物會一起吸附在SPE柱上，需要在目標(biāo)化合物被洗脫前用合適的清洗流動(dòng)相除去部分的干擾物。在所選用的ZORBAX Eclipse Plus C18柱上，適當(dāng)提高清洗流動(dòng)相中有機(jī)相的比例可以改善去除雜質(zhì)的效果，然而若有機(jī)相比例過高， 會使pNA從SPE柱上被過早洗脫下來，造成目標(biāo)化合物的流失。結(jié)果表明，使用0.05%甲酸乙腈（9∶1， V/V）作為清洗流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min時(shí)，去除酶反應(yīng)溶液中的蛋白和鹽類等物質(zhì)的效果較好，主要雜質(zhì)可以在前1.2 min內(nèi)基本除去，且可使pNA及內(nèi)標(biāo)物保留在SPE柱上。由此確定閥B切換使在線SPE柱與分析柱串聯(lián)的時(shí)間點(diǎn)為1.2 min。

考察了不同比例的水乙腈體系作為洗脫流動(dòng)相的效果。

結(jié)果表明，采用水乙腈（4∶6，V/V）可以有效地將pNA和內(nèi)標(biāo)物從在線SPE柱上洗脫下來，同時(shí)該流動(dòng)相條件也可以使pNA和內(nèi)標(biāo)物在分析柱上進(jìn)行有效的分離（圖2）。目標(biāo)化合物于在線SPE柱上的洗脫和分析柱上的分離串聯(lián)進(jìn)行，有效簡化了分析步驟，減少了閥切換的次數(shù)，使得方法更為穩(wěn)定可靠。

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對Xa因子和IIa因子催化的酶反應(yīng)溶液進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖2所示。pNA和ISTD分別在1.93和2.14 min出峰，分離度和峰形良好。樣品經(jīng)在線SPE柱處理后，有效減少了復(fù)雜樣品基質(zhì)對質(zhì)譜分析的影響。同時(shí)，采用 MRM 檢測的掃描模式進(jìn)一步降低了雜質(zhì)的干擾。

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及定量下限 取2.2節(jié)配制的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行在線SPE/LCMS分析，以pNA和內(nèi)標(biāo)的峰面積之比（I/I0）為縱坐標(biāo)，pNA濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合和回歸分析，其中線性回歸權(quán)重系數(shù)為1/x2。結(jié)果表明，在3～1000 μg/L濃度范圍內(nèi)，I/I0與反應(yīng)產(chǎn)物pNA濃度具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9995，線性方程為y=0.277x+0.003。根據(jù)10倍信噪比計(jì)算pNA的定量下限（LLOQ）為3 μg/L。

3.2.2 特異性 在優(yōu)化的在線固相萃取、色譜分離和質(zhì)譜檢測條件下，分別分析抗IIa因子和抗Xa因子的空白效價(jià)反應(yīng)體系，考察方法的特異性。從圖3可見，空白抗IIa效價(jià)反應(yīng)體系和空白抗Xa因子效價(jià)反應(yīng)體系中未檢出干擾pNA檢測的信號。

3.2.3 準(zhǔn)確度和精密度 分析方法的準(zhǔn)確度用于描述測得值與分析物標(biāo)示濃度的接近程度。精密度用于描述重復(fù)測定結(jié)果的接近程度。取低、中、高3種不同濃度的質(zhì)控樣品分別連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣時(shí)確保濃度從低至高，測定對應(yīng)峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，用于表征方法的日內(nèi)精密度。將3個(gè)濃度的樣品，每天檢測6次，連續(xù)檢測3天，獲得方法的日內(nèi)精密度。方法的精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果見表 1。 pNA分析方法的日內(nèi)與日間精密度分別為1.1%～5.4%和3.8%～10.9%， 準(zhǔn)確度為88.8%～100.6%。方法的準(zhǔn)

確度和精密度均符合藥典要求。

3.2.4 基質(zhì)效應(yīng) 質(zhì)譜作為定量分析檢測手段時(shí)，離子化時(shí)基質(zhì)中的一些物質(zhì)會與目標(biāo)化合物發(fā)生競爭，使得目標(biāo)化合物的離子化效率增加或降低，從而導(dǎo)致其響應(yīng)值的提高或降低。通過比較等濃度pNA在空白效價(jià)反應(yīng)基質(zhì)與緩沖液中的響應(yīng)值評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。在由酶（IIa因子、Xa因子和AT Ⅲ）、緩沖鹽溶液和肝素混合組成的空白效價(jià)反應(yīng)溶液中按質(zhì)控樣品的低、中、高3個(gè)濃度水平加入pNA標(biāo)準(zhǔn)品，與其對應(yīng)的質(zhì)控樣品比較（表1）?？瞻仔r(jià)反應(yīng)基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)在89.9%～96.9%之間，說明本方法中空白效價(jià)反應(yīng)溶液對pNA定量及效價(jià)檢定影響較小，在可接受的范圍內(nèi)。

3.2.5 穩(wěn)定性 考察了經(jīng)乙腈淬滅并等體積添加內(nèi)標(biāo)物后的效價(jià)反應(yīng)溶液在不同條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。3個(gè)濃度水平的樣品在室溫放置12 h、Symbolm@@4℃下保存24 h以及48 h內(nèi)進(jìn)行3次凍融循環(huán)（Symbolm@@20℃和室溫）后，測得pNA的濃度與新配制的相應(yīng)濃度質(zhì)控樣品的比值在102.1%～109.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.8%～12.3%之間，表明不同條件存儲后pNA未明顯變化，pNA在效價(jià)反應(yīng)體系中具有良好的穩(wěn)定性。

3.3 測定肝素鈉供試品生物效價(jià)

肝素類藥物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其活性不能用單純的重量單位描述，需要以藥典對照品的活性為參照，獲得標(biāo)準(zhǔn)化的活性單位，從而保證病人的用藥劑量在使用不同來源藥品時(shí)保持一致。2015年版《中國藥典》三部收載1431生物鑒定統(tǒng)計(jì)法[29]，其中一種方法為量反應(yīng)平行線法。量反應(yīng)是指藥物對生物體所引起的反應(yīng)隨著藥物劑量的增加產(chǎn)生的量變可以測量者。量反應(yīng)平行線測定法要求在一定劑量范圍內(nèi)，生物檢定標(biāo)準(zhǔn)品（S）和供試品（T）的對數(shù)劑量和反應(yīng)或反應(yīng)的特定函數(shù)呈直線關(guān)系，當(dāng)S和T的活性組分基本相同時(shí)，兩直線平行。按照上述方法對兩個(gè)肝素鈉供試品進(jìn)行生物效價(jià)的測定，結(jié)果如圖4所示，肝素鈉供試品和肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的產(chǎn)物產(chǎn)生量和肝素濃度的對數(shù)值的曲線基本呈平行線。采用本方法，以肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品（150509200912）作為對照，利用量反應(yīng)平行線原理4×4法計(jì)算供試品效價(jià)，結(jié)果見表3。供試品1的抗IIa因子效價(jià)和抗Xa因子效價(jià)分別為196.06和196.05 IU/mL，供試品2的抗IIa因子效價(jià)和抗Xa因子效價(jià)分別為195.92和196.07 IU/mL。另外，對于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用量反應(yīng)平行線4×4法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，效價(jià)的可信限率（FL，%）均小于10%，且回歸顯著（p<0.01），偏離平行、二次曲線，反向二次曲線偏差均不顯著（p>0.05），說明檢定結(jié)果可靠。文獻(xiàn)＼[30＼]報(bào)道肝素的抗Xa因子與抗IIa因子的效價(jià)比≈1。本方法測定的兩個(gè)肝素鈉供試品的抗Xa因子效價(jià)與抗IIa因子的效價(jià)比均為1.00，與文獻(xiàn)＼[30＼]報(bào)道的結(jié)果一致。按照美國藥典收載的肝素鈉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求，兩個(gè)肝素鈉供試品的抗Xa因子效價(jià)與抗IIa因子效價(jià)的比值在0.9～1.1范圍內(nèi)。肝素鈉效價(jià)按干燥品計(jì)算1 mg活性需大于180 IU。本方法測定的兩個(gè)肝素鈉供試品的生物效價(jià)指標(biāo)符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。綜上，本研究開發(fā)的基于在線固相萃取/液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析測得肝素鈉生物效價(jià)的方法是準(zhǔn)確可行的。

3.4 與藥典方法[16]的比較

將本方法與2015版《中國藥典》二部中肝素鈉效價(jià)測定中抗IIa因子和抗Xa因子測定方法進(jìn)行了對比。結(jié)果表明，本方法中酶和底物的用量減少，節(jié)省了檢測成本; 在線固相萃取操作簡單，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，減少了人為操作帶來的誤差; 在線SPE色譜柱可以多次使用，降低了成本。

4 結(jié) 論

建立了在線固相萃取/液相色譜質(zhì)譜（online SPE/LCMS）聯(lián)用方法，用于肝素類藥物生物效價(jià)的測定方法。本方法直接分析經(jīng)稀釋過濾的IIa因子和Xa因子的酶催化反應(yīng)溶液，靈敏度高，樣品無需進(jìn)行前處理，操作簡單快捷，靈敏度高，方法重現(xiàn)性好，并獲得了較好的準(zhǔn)確度和精密度。系統(tǒng)的方法學(xué)考察表明， 本方法可滿足肝素鈉生物效價(jià)測定的分析要求，為生產(chǎn)中肝素鈉的質(zhì)量評估提供了新方法。

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