吳澤，陳天發(fā)，曾志凡，張義為，湯真，蘇開元，范辰韻，李士林

（1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438；2.蘇州市吳江區(qū)公安局，江蘇 蘇州 215200）

Y染色體遺傳標(biāo)記由于其父系遺傳的特點(diǎn)，在法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別、混合樣本鑒定、家系溯源等方面應(yīng)用廣泛[1]，其中又以Y染色體短串聯(lián)重復(fù)（Y chromosome short tandem repeat，Y-STR）序列和Y染色體單核苷酸多態(tài)性（Y chromosome single nucleotide polymorphism，Y-SNP）應(yīng)用最為廣泛。Y-SNP與Y-STR相比具有極低的突變率（約為3.0×10-8）[2]，并且基本不會(huì)出現(xiàn)回復(fù)突變。精確的Y-SNP單倍群可以對(duì)應(yīng)到一個(gè)或幾個(gè)Y-STR單倍型，即對(duì)應(yīng)到一個(gè)或數(shù)個(gè)家系，相對(duì)于分布著大量Y-STR單倍型、只能依靠基因座遺傳頻率排序歸類進(jìn)行大海撈針式的粗糙數(shù)據(jù)處理的人群來說，自有排序體系的Y-SNP單倍群分類系統(tǒng)更為直觀簡(jiǎn)便，對(duì)于數(shù)據(jù)庫(kù)體系的構(gòu)建也有著更為重要的價(jià)值。

目前基于Y-STR單倍型建立的數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)中，由于篩選了部分高突變STR遺傳標(biāo)記，來自不同祖先的漢族男性個(gè)體Y-STR單倍型可能與其他漢族男性個(gè)體Y-STR單倍型一致，或者存在1～3個(gè)STR位點(diǎn)基因型不同，那么，僅利用Y-STR單倍型數(shù)據(jù)進(jìn)行家系排查及確定案件偵查方向時(shí)，就會(huì)存在很多的假陽(yáng)性結(jié)果。對(duì)基于Y-STR單倍型的數(shù)據(jù)庫(kù)，通過加入家系特異性SNP遺傳標(biāo)記，可以更科學(xué)準(zhǔn)確地定位現(xiàn)場(chǎng)嫌疑人的相關(guān)男性家系，從而使Y染色體數(shù)據(jù)庫(kù)成為功能更強(qiáng)大的偵破工具。

考慮到上述Y-STR和Y-SNP遺傳標(biāo)記各自的特點(diǎn)以及Y-SNP單倍群的家系特異性和區(qū)域特異性，在構(gòu)建特定地區(qū)的Y染色體數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，需要聯(lián)合考慮區(qū)域人群的Y-STR和Y-SNP，并分析家系特異性的核心單倍群和區(qū)域特異性的遺傳結(jié)構(gòu)。本研究對(duì)蘇州吳江地區(qū)（橫扇鎮(zhèn)、平望鎮(zhèn)和七都鎮(zhèn)）472名漢族男性個(gè)體進(jìn)行Y-STR分型、Y-SNP推斷和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并聯(lián)系Y-STR單倍型和Y-SNP核心家系單倍群，進(jìn)一步分析其鄉(xiāng)鎮(zhèn)人群的遺傳結(jié)構(gòu)，為實(shí)現(xiàn)精確的家系溯源提供理論支持，為該地區(qū)Y染色體數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本

隨機(jī)采集472名蘇州市吳江地區(qū)（橫扇鎮(zhèn)、平望鎮(zhèn)和七都鎮(zhèn)）漢族男性個(gè)體的末梢血樣本，保存于FTA采血卡（英國(guó)Whatman公司）。樣本采集遵照知情同意原則。

1.2 試劑與儀器

YfilerTMPlus PCR擴(kuò)增試劑盒、甲酰胺（Hi-DiTM）、分子量?jī)?nèi)標(biāo)GeneScanTM500 LIZTM均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，分子量?jī)?nèi)標(biāo)QD550購(gòu)自閱微基因技術(shù)有限公司，9700型PCR儀、3500xL基因分析儀均購(gòu)自美國(guó)AB公司。

1.3 PCR擴(kuò)增

按照YfilerTMPlus PCR擴(kuò)增試劑盒說明書，對(duì)472份血卡采用直接擴(kuò)增法在9700型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為 10 μL，包含引物 4 μL、PCR Mix 2μL、ddH2O 4μL。血卡打孔直徑1.2mm。PCR程序：95℃變性1 min；94℃ 4 s，61.5℃ 1 min，60℃22min，共30個(gè)循環(huán)；60℃延伸22min；4℃保存。

1.4 電泳與分型檢測(cè)

按照甲酰胺（Hi-DiTM）1 000 μL+GeneScanTM500 LIZTM標(biāo)準(zhǔn)品20μL配制混合液，分裝時(shí)每孔加入8μL混合液和1μL PCR產(chǎn)物，在3500xL基因分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。使用GeneMapper ID-X v1.2軟件進(jìn)行基因分型。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用直接計(jì)算法計(jì)算各基因座的等位基因頻率和單倍型頻率，基因多樣性（gene diversity，GD）和單倍型多樣性（haplotype diversity，HD）的計(jì)算公式如下：

其中n為樣本數(shù)，pi為等位基因頻率或單倍型頻率。

用本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的Y-Predictor軟件（待發(fā)表），根據(jù)27個(gè)Y-STR數(shù)據(jù)推測(cè)各樣本的Y-SNP單倍群。Y-Predictor的數(shù)據(jù)庫(kù)是由本實(shí)驗(yàn)室在千人基因組計(jì)劃Ⅲ期中篩選分析東亞地區(qū)Y-SNP和對(duì)應(yīng)的YSTR得到的數(shù)據(jù)，根據(jù)Y-SNP單倍群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，一個(gè)樣本的Y-STR單倍型可以通過其所屬的YSNP單倍群追溯到系統(tǒng)發(fā)生樹具體的支上。通過計(jì)算待測(cè)樣本的Y-STR單倍型與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的YSTR單倍型之間的遺傳距離，就能夠判斷其在系統(tǒng)發(fā)生樹上的位置[3]。兩個(gè)Y-STR單倍型遺傳距離（d）的計(jì)算公式[4]如下：

其中n為參與計(jì)算的Y-STR基因座數(shù)目，ai為待測(cè)樣本A第i個(gè)Y-STR基因座的等位基因的數(shù)值，bi為已知樣本B第i個(gè)Y-STR基因座的等位基因的數(shù)值，mi為第i個(gè)Y-STR基因座的突變速率。根據(jù)待測(cè)樣本與數(shù)據(jù)庫(kù)中每一個(gè)已知樣本之間的遺傳距離，通過加權(quán)算法可以推測(cè)出與該樣本最接近的3個(gè)Y-SNP單倍群。

對(duì)于推測(cè)的結(jié)果：若同一樣本的3個(gè)結(jié)果來自相同的Y-SNP大支，且權(quán)重合計(jì)大于80%，則認(rèn)為推測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確；若推測(cè)結(jié)果距離較遠(yuǎn)或權(quán)重過低，則認(rèn)為推測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

1.6 Y-SNP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

為了驗(yàn)證Y-Predictor軟件推測(cè)的Y-SNP單倍群是否準(zhǔn)確，通過擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)（amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction，ARMS-PCR）對(duì)吳江地區(qū)427名漢族男性樣本的E-M96、D-JST021355、N-M231、C-M130、OP186、O1-M119、O2-M122、O1b-M268、O1b2-M176、O2a1-KL1、O2a2b1a1-M117（Page23）、O2a2a1a2-M7、O2a2b-P164、N1a1-M46、D1a1a1-N1、O2a2-P201、D1a2a-P47、C2-M217、I-M170、IJ-M429、K-M9、QRM45、G-M201M201、IJKLT-M522共24個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢驗(yàn)。反應(yīng)體系為 25 μL，包含引物 5 μL、Master Mix 10μL、ddH2O 10μL。PCR條件：95℃變性5min；94℃ 20s，59℃ 90s，共30個(gè)循環(huán)；60℃延伸60min；4℃保存。按照甲酰胺（Hi-DiTM）1000μL+分子量?jī)?nèi)標(biāo)QD550 30 μL配制混合液，分裝時(shí)每孔加入8 μL混合液和1μL PCR產(chǎn)物，在3500xL基因分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。使用GeneMapper ID-X v1.2軟件進(jìn)行基因分型。

2 結(jié) 果

蘇州市吳江地區(qū)472名漢族男性人群27個(gè)Y-STR基因座的等位基因頻率分布見表1。472名漢族男性樣本中，共檢出453種單倍型，其中435種單倍型出現(xiàn)1次、17種出現(xiàn)2次、1種出現(xiàn)3次，人群的HD值為0.997 696 93。除DYS385a/b和DYF387S1a/b以外的23個(gè)Y-STR基因座共檢出等位基因182種，各基因座檢出4～16個(gè)等位基因，頻率分布在0.002 1～0.809 3。DYS385a/b基因座共檢出42種單倍型，頻率分布在0.0021～0.1695。DYF387S1a/b基因座共檢出36種單倍型，頻率分布在0.0021～0.0890。

表1 蘇州市吳江地區(qū)漢族男性人群27個(gè)Y-STR基因座的等位基因頻率 （n=472）

續(xù)表1

27個(gè)Y-STR位點(diǎn)的GD值見表2，范圍在0.3218～0.9531。其中DYF387S1a/b的GD值最高（0.9531），其次是 DYS385a/b（0.9478）、DYS449（0.8584）和 DYS627（0.844 7）。DYS438的GD值最低（0.321 8），其次是DYS391（0.4075）、DYS437（0.4536）和 DYS533（0.4704），除此4個(gè)基因座外，其余基因座的GD值均大于0.5。

表2 蘇州市吳江地區(qū)漢族男性人群27個(gè)Y-STR基因座的GD值 （n=472）

采用Y-Predictor軟件根據(jù)吳江地區(qū)472名漢族男性個(gè)體27個(gè)Y-STR數(shù)據(jù)推測(cè)其各自的Y-SNP單倍群，得到來自C、D、N、O和Q等單倍群下游的132種不同的單倍群，其中推測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的有352個(gè)，分布如表3所示。

表3 吳江地區(qū)3個(gè)鎮(zhèn)區(qū)人群的Y-SNP核心單倍群（個(gè)）

從表3可以看出：在推測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的352個(gè)個(gè)體中，214名個(gè)體來自O(shè)1和O2單倍群分支，超過總?cè)藬?shù)的60%，統(tǒng)計(jì)加入Oα、Oβ和Oγ單倍群時(shí)達(dá)291人（82.67%）；O單倍群的比例在79.74%（平望鎮(zhèn)）至86.75%（橫扇鎮(zhèn)），在橫扇鎮(zhèn)和七都鎮(zhèn)占比超過80%，其中除O2在橫扇鎮(zhèn)（31.33%）占最高比例以外，其余兩鎮(zhèn)中均為O1占比最高，分別為35.29%（平望鎮(zhèn)）和43.97%（七都鎮(zhèn)）。此外，Oα、Oβ和Oγ單倍群在各鎮(zhèn)區(qū)中也占18.97%（七都鎮(zhèn)）至28.92%（橫扇鎮(zhèn)），而C單倍群的比例在3.61%（橫扇鎮(zhèn)）至15.03%（平望鎮(zhèn)），N單倍群的比例在4.58%（平望鎮(zhèn)）至7.76%（七都鎮(zhèn)），而D和Q單倍群占比在0.00%～3.61%。

為了驗(yàn)證軟件推測(cè)的Y-SNP結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)認(rèn)定為推測(cè)準(zhǔn)確的352個(gè)樣本和推測(cè)不準(zhǔn)確的120個(gè)樣本分別進(jìn)行了ARMS-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。352個(gè)認(rèn)定為推測(cè)準(zhǔn)確的樣本，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果的單倍群大支與推測(cè)結(jié)果完全一致，表明按照本篩選標(biāo)準(zhǔn)得到的軟件推測(cè)結(jié)果較為可靠；認(rèn)定為推測(cè)不準(zhǔn)確的120個(gè)樣本中，41個(gè)樣本的分型結(jié)果屬于O2a1，20個(gè)樣本屬于O1b，1個(gè)樣本屬于D1a1，有58個(gè)樣本在IJK單倍群下游不能細(xì)分，需要進(jìn)一步檢測(cè)更多SNP位點(diǎn)。圖1展示了兩個(gè)認(rèn)定為推測(cè)不準(zhǔn)確樣本的分型結(jié)果，其中：圖1A樣本的推測(cè)結(jié)果為C2b1但權(quán)重不足10%，其分型結(jié)果為O2a1；圖1B樣本的推測(cè)結(jié)果為D1a1或C2b1，分型結(jié)果驗(yàn)證其為D1a1。

圖1 兩個(gè)認(rèn)定為推測(cè)不準(zhǔn)確樣本的ARMS-PCR檢測(cè)結(jié)果

在3個(gè)鎮(zhèn)區(qū)人群中，O1a1a1a1a*-F794是其共有的核心單倍群，聚類了67個(gè)不同家系的Y-STR單倍型（橫扇鎮(zhèn)10個(gè)、平望鎮(zhèn)28個(gè)、七都鎮(zhèn)29個(gè)），與其鄰近的O1a1a1a1*-SK1567也有來自平望鎮(zhèn)（12個(gè)）和七都鎮(zhèn)（9個(gè)）的21個(gè)家系。此外，平望鎮(zhèn)另有來自O(shè)1a1a1a1a*-F4149、O1a1a1a1a1-F707等9個(gè)O1下游單倍群的14個(gè)家系，七都鎮(zhèn)另有來自O(shè)1a1a1a1*-SK1527、O1b1a2a1-F977等8個(gè)O1下游單倍群的13個(gè)家系，構(gòu)成各自區(qū)域的核心單倍群和核心家系；橫扇鎮(zhèn)則有來自O(shè)2a2a1a2a1c1-F863、O2a1c1b1a12*-F806、O2a2a2a*-F2216等17個(gè)O2下游單倍群的26個(gè)家系，構(gòu)成其核心單倍群和核心家系。

根據(jù)橫扇鎮(zhèn)O2單倍群樣本繪制網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），可以看到相同單倍群的家系聚集成簇，而簇又大致形成距離較遠(yuǎn)的兩個(gè)大簇，聚集成大簇的家系基本屬于相近的單倍群。

圖2 橫扇鎮(zhèn)O2單倍群27個(gè)Y-STR的網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

吳江古時(shí)為蘇州府吳江縣，以吳江（現(xiàn)吳淞江）為名，始建于后梁開平三年（公元909年），吳江地處南北漕運(yùn)走廊，大運(yùn)河穿過松陵鎮(zhèn)，水系發(fā)達(dá)的平望則是連接周邊的交通樞紐，發(fā)達(dá)的絲綢產(chǎn)業(yè)吸引大量外來人口至此從事繅絲、紡經(jīng)和往來貿(mào)易，使得這些商業(yè)發(fā)達(dá)的鎮(zhèn)區(qū)有了頻繁的人群流動(dòng)[5]。而比鄰太湖的橫扇、七都等鎮(zhèn)由于其充沛的水源和肥沃的土地，主要以發(fā)展?jié)O業(yè)和農(nóng)業(yè)為主，人群一般世代在本地聚居，形成了相對(duì)固定的本地主要家系[6]。對(duì)于這樣群體結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜的地區(qū)，家系遺傳結(jié)構(gòu)的具體分析在數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)中顯得尤為重要。

Y-SNP突變具有迭代累加的特性，比如當(dāng)某個(gè)父親Y染色體上某個(gè)SNP位點(diǎn)發(fā)生了A突變，那么他的所有男性后代的Y染色體上都會(huì)出現(xiàn)A這種突變。如果這群人中的某個(gè)人的另一個(gè)SNP位點(diǎn)出現(xiàn)了B突變，那么這個(gè)人的男性后代就會(huì)同時(shí)出現(xiàn)A和B兩種突變，故根據(jù)Y-SNP位點(diǎn)突變基因型可以定位男性家系的特異性遺傳標(biāo)記[7]。

除了家系特異性以外，由于人類走出非洲后形成了不同的遷徙路線[8]，Y-SNP單倍群在地域上也有著鮮明的特異性分布。在東亞地區(qū)最為常見的單倍群C、D、N、O中，C主要出現(xiàn)在北亞、東亞、大洋洲和美洲人群[9-10]，D則只出現(xiàn)在亞洲，尤其是中國(guó)西藏和日本[10-12]，N 廣泛分布于亞歐大陸[7，13]，而東亞地區(qū)人群80%～90%都屬于單倍群O[14-18]。

本研究在蘇州市吳江地區(qū)獲取了472名橫扇鎮(zhèn)、平望鎮(zhèn)及七都鎮(zhèn)本地隨機(jī)男性樣本的完整27個(gè)YSTR基因型。為提高Y-STR技術(shù)的群體溯源和家系排查能力，本研究在Y-STR結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用YPredictor軟件和ARMS-PCR技術(shù)，引入Y-SNP遺傳標(biāo)記對(duì)家系進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)分，結(jié)果表明，C、D、N、O和Q單倍群在3個(gè)鎮(zhèn)區(qū)人群中均有分布但差異明顯，其中以O(shè)單倍群為主（占總體82.67%），與東亞人群的分布[2，7-8]基本相符合，而D和Q單倍群則分布極少。這一方面是由于此類單倍群人群在當(dāng)?shù)乇旧聿欢?，另一方面則是因?yàn)閅-Predictor軟件對(duì)吳江地區(qū)人群中推測(cè)為此類單倍群的樣本給出了不同的推測(cè)結(jié)果或較低的可信程度，因此許多樣本被認(rèn)定為推斷不準(zhǔn)確，在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過程中，發(fā)現(xiàn)了1例來自D1a1單倍群的樣本，對(duì)于其他無法細(xì)分的樣本則需要檢測(cè)更多SNP位點(diǎn)以確認(rèn)其具體單倍群。

根據(jù)Y-STR和Y-SNP的結(jié)果來看，橫扇鎮(zhèn)的人群結(jié)構(gòu)可劃分為兩個(gè)主要的單倍群。由于橫扇鎮(zhèn)比鄰太湖，從明清開始就形成了發(fā)達(dá)的捕魚業(yè)，且地處太湖沖積平原，氣候和土地條件適宜耕作。據(jù)《乾隆震澤縣志》記載，橫扇人群主要為漁民、農(nóng)民聚居，人員流動(dòng)較少，因此形成了較為穩(wěn)定的本地家系。而清道光年間，有難民自河南逃難至此，于太湖以南的灘涂圍墾湖田，由于此處天然肥沃的土地和充沛的水源，便成功以務(wù)農(nóng)在此定居[19]。因此，距離較遠(yuǎn)的另一簇樣本則很可能與此次人群遷徙有關(guān)。因此本地世居從事漁農(nóng)的人群和外來逃難、務(wù)農(nóng)定居的人群共同組成了如今的橫扇群體。

綜上所述，本研究利用Y-STR復(fù)合Y-SNP研究，對(duì)鄉(xiāng)鎮(zhèn)級(jí)別區(qū)域人群的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，得到了區(qū)域核心單倍型和核心家系。本研究方法和數(shù)據(jù)適用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的親權(quán)鑒定和家系溯源，為公安系統(tǒng)重點(diǎn)人群監(jiān)控和實(shí)際案件中精確個(gè)體識(shí)別提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)手段，為建設(shè)具有吳江地區(qū)特色的Y染色體數(shù)據(jù)庫(kù)提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。