(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

安絡(luò)小皮傘菌(Marasmiusandrosaceus)是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用真菌，野生種質(zhì)主要著生于濕潤(rùn)多雨的枯木落葉上[1,2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中培養(yǎng)其菌絲體，經(jīng)抽提，制成止痛浸膏或膠囊，具有止痛消炎等功效，對(duì)三叉神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛、面神經(jīng)麻痹、偏頭痛和風(fēng)濕性關(guān)炎等療效較好；對(duì)中輕度麻風(fēng)神經(jīng)痛、腰肌勞損等也有緩解作用[3～6]。而安絡(luò)小皮傘多糖是安絡(luò)小皮傘菌的重要活性物質(zhì)之一[5,6]，更是具有抗高血壓、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗慢性肝炎等多種功效[5～9]，因此，怎樣增加其多糖的提取量十分關(guān)鍵。目前，主要采用誘變技術(shù)、優(yōu)化培養(yǎng)基和優(yōu)化提取工藝提高安絡(luò)小皮傘多糖的提取量[10～12]。

茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate, MeJa)是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物中廣泛存在，作為植物抗病信號(hào)傳遞體之一，影響了局部或系統(tǒng)的抗性[13]；作為與損傷相關(guān)的植物激素和信號(hào)分子，外源應(yīng)用能夠激發(fā)防御植物基因的表達(dá)，誘導(dǎo)植物的化學(xué)防御，產(chǎn)生與機(jī)械損傷和昆蟲(chóng)取食相似的效果[14]。水楊酸(Salicylic Acid, SA)是一種植物體內(nèi)產(chǎn)生的具有生理調(diào)節(jié)作用的酚類化合物，作為重要的信號(hào)分子，可以誘導(dǎo)逆境相關(guān)蛋白的表達(dá)、激活植物超敏反應(yīng)和系統(tǒng)獲得抗病、抗旱、抗冷的特性以及調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化機(jī)制等[13～15]，從而提高植物對(duì)逆境脅迫的耐受能力。

植物激素不僅對(duì)植物生長(zhǎng)具有重大的調(diào)節(jié)作用，而且針對(duì)靈芝等大型真菌生理反應(yīng)也存在一定的調(diào)控作用[16]。為此，筆者在安絡(luò)小皮傘液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中添加水楊酸或茉莉酸甲酯后，考察了這2種激素對(duì)安絡(luò)小皮傘菌(Marasmiellusandrosaceus)的生物量及多糖含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

安絡(luò)小皮傘菌由湖北欣愷生物有限公司提供，長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar, PDA)固態(tài)培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，15～20g瓊脂，葡萄糖20g，水1000mL，自然pH。

馬鈴薯葡萄糖液態(tài)培養(yǎng)基(PDB)：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。

1.1.3 主要藥品與試劑

包括葡萄糖、瓊脂、3,5 -二硝基水楊酸、茉莉酸甲酯、乙醇、苯酚(重蒸)、濃硫酸等，均為分析純級(jí)。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；BS-IE振蕩培養(yǎng)箱(國(guó)華電器有限公司)；HFsafe-1200超凈工作臺(tái)(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；HVE-50立體式高壓滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司)；HH-4恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)；UV-1800紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；DL-5-C高速冷凍離心機(jī)(上海市離心機(jī)械研究所)；ET-2010KA立式雙門回旋搖床(金壇市億通電子有限公司)；YE4A349120移液槍(北京金花儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng)

將保藏的安絡(luò)小皮傘菌種接入含100mL的PDA培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，25℃恒溫培養(yǎng)7d，存冰箱中備用。

1.2.2 孢子懸液的制備

20mL無(wú)菌蒸餾水加入到250mL三角瓶斜面培養(yǎng)基上，用接種環(huán)將培養(yǎng)基斜面上的孢子輕輕刮下，倒入帶有4層擦鏡紙的滅菌漏斗中過(guò)濾，然后將過(guò)濾的安絡(luò)小皮傘菌液倒入盛有滅菌小玻璃珠的50mL三角瓶中，25℃、150r/min震蕩15min，將孢子充分打散，得到均勻的單孢子懸液。

1.2.3 水楊酸和茉莉酸甲酯對(duì)安絡(luò)小皮傘菌產(chǎn)多糖的影響

將先配制好的0.1mol/L的水楊酸/茉莉酸甲酯溶液，向培養(yǎng)基中分別按梯度加入水楊酸 (0、10、50、100、250、500、750、1000μmol/L) 或者茉莉酸甲酯(0、10、30、50、70、90、110μmol/L)(此濃度為培養(yǎng)基中的終濃度)。經(jīng)此初選后，再?gòu)?fù)篩水楊酸 (650、700、750、800、850μmol/L) 或者茉莉酸甲酯(80、85、90、95、100μmol/L)的濃度，確定促進(jìn)安絡(luò)小皮傘菌胞內(nèi)多糖(Intracellular polysaccharide,IPS)和胞外多糖(Extracellular polysaccharide, EPS)產(chǎn)量最大的濃度。每個(gè)梯度做3個(gè)平行試驗(yàn)組。

1.2.4 水楊酸和茉莉酸甲酯對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

將得到的菌懸液吸取2mL菌懸液加入到滅菌過(guò)的裝有100mL PDB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶。將加入800μmol/L水楊酸和90μmol/L茉莉酸甲酯的菌懸液分別作為處理組與對(duì)照組一起放入恒溫?fù)u床中，25℃、150/min培養(yǎng)14d。每隔2d測(cè)1次生物量，記錄安絡(luò)小皮傘菌株的生物量的變化。

1.2.5 多糖含量的測(cè)定

多糖含量的測(cè)定采用苯酚硫酸法[5]。

1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法參照文獻(xiàn)[5]，得出溶液在490nm處的光密度(x)與標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液濃度(y,mg/mol)的回歸方程:y=4.1964x+0.06746，決定系數(shù)R2=0.99937。

2)樣品中多糖含量的測(cè)定 樣品中IPS濃度的測(cè)定：分別收集發(fā)酵后的菌絲體，蒸餾水清洗后進(jìn)行干燥至恒重，稱取并記錄菌體的生物量，取0.03g充分水浸醇沉后溶于5mL蒸餾水，取1mL稀釋至5mL，后取2mL參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法在490nm 處測(cè)定溶液的光密度，并代入回歸方程算出浸提液濃度，計(jì)算IPS的產(chǎn)量(mg/g)。

樣品中EPS含量的測(cè)定：收集發(fā)酵液(100mL)，取1mL發(fā)酵液醇沉，沉淀溶解于5mL蒸餾水中，再取1mL稀釋至5mL，后取2mL參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法在490nm處測(cè)定溶液的光密度，并代入回歸方程算出浸提液濃度，計(jì)算EPS的產(chǎn)量(mg/100mL)。

1.2.6 安絡(luò)小皮傘菌生物量的測(cè)定

安絡(luò)小皮傘菌生物量采取菌體干重法測(cè)定[8]。將安絡(luò)小皮傘菌發(fā)酵液全部轉(zhuǎn)入離心管中，10000r/min的條件下離心4min，過(guò)濾得到安絡(luò)小皮傘的菌體組織。稱重記錄其濕重再放入60℃的烘箱中烘干。每隔5h測(cè)1次凈重，直到重量不發(fā)生變化為止，此時(shí)的重量即為菌體的凈重。

2 結(jié)果與分析

2.1 水楊酸對(duì)安絡(luò)小皮傘菌產(chǎn)多糖的影響

不同濃度水楊酸下安絡(luò)小皮傘菌的多糖產(chǎn)量如圖1所示。由圖1(a)可知，當(dāng)水楊酸濃度高于10μmol/L后，隨著水楊酸濃度的增加，IPS和EPS產(chǎn)量也在增加；在750μmol/L濃度時(shí)，兩者的產(chǎn)量到達(dá)一個(gè)峰值，分別為151.12mg/g和485.58mg/100mL。再以750μmol/L為中心，進(jìn)行小范圍復(fù)篩水楊酸促進(jìn)安絡(luò)小皮傘菌多糖產(chǎn)量的最適濃度，其結(jié)果如1(b)所示。由圖1(b)可知，在水楊酸濃度為800μmol/L時(shí)，2種多糖產(chǎn)量均達(dá)到峰值，即此濃度為水楊酸對(duì)安絡(luò)小皮傘菌細(xì)胞產(chǎn)IPS的最佳促進(jìn)濃度，此時(shí)IPS產(chǎn)量為158.36mg/g，較對(duì)照組增長(zhǎng)了52.82%； EPS產(chǎn)量為497.65mg/100mL，較對(duì)照組增長(zhǎng)了60.53%。

圖1 不同水楊酸濃度下的胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量

2.2 茉莉酸甲酯對(duì)安絡(luò)小皮傘菌產(chǎn)多糖的影響

不同濃度茉莉酸甲酯下安絡(luò)小皮傘菌的多糖產(chǎn)量如圖2所示。由圖2(a)可知，當(dāng)茉莉酸甲酯濃度在10～90μmol/L時(shí)， 隨著茉莉酸甲酯濃度的增加，IPS和EPS產(chǎn)量也隨之增加。在濃度為90μmol/L時(shí)，IPS和EPS的產(chǎn)量均達(dá)到最大。再以90μmol/L為中心，確定茉莉酸甲酯促進(jìn)安絡(luò)小皮傘多糖產(chǎn)量的最適濃度，其結(jié)果圖2(b)所示。由圖2(b)可知，在茉莉酸甲酯濃度為90μmol/L時(shí)，多糖產(chǎn)量先增后降，在90μmol/L時(shí)達(dá)到峰值，IPS和EPS產(chǎn)量均達(dá)到最大。即此濃度為茉莉酸甲酯對(duì)安絡(luò)小皮傘產(chǎn)IPS和EPS的最佳促進(jìn)濃度。此時(shí)IPS產(chǎn)量為159.88mg/g，較對(duì)照組增長(zhǎng)了48.24%； EPS產(chǎn)量為465.25mg/100mL，較對(duì)照組增長(zhǎng)了44.19%。

圖2 不同濃度茉莉酸甲酯下胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量

2.3 水楊酸和茉莉酸甲酯對(duì)安絡(luò)小皮傘菌生長(zhǎng)的影響

圖3 水楊酸和茉莉酸甲酯處理下不同發(fā)酵時(shí)間 的安絡(luò)小皮傘菌生物量

將加入800μmol/L水楊酸和90μmol/L茉莉酸甲酯的菌懸液分別作為處理組與對(duì)照組一起在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)14d，每隔2d測(cè)1次生物量，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在安絡(luò)小皮傘的緩慢生長(zhǎng)期(1～4d)內(nèi)，2個(gè)處理組與對(duì)照組相比，動(dòng)力學(xué)趨勢(shì)基本一致。緩慢生長(zhǎng)期基本上不發(fā)生變化?？焖偕L(zhǎng)期(4～12d)時(shí)，菌體的動(dòng)力學(xué)曲線斜率明顯增大，單位時(shí)間內(nèi)菌體指標(biāo)變化加快，物質(zhì)積累增長(zhǎng)率變大。其中水楊酸對(duì)安絡(luò)小皮傘的生長(zhǎng)量影響明顯，從第4天起，2個(gè)處理組的菌體開(kāi)始快速增長(zhǎng)，第8天后，水楊酸處理組的生長(zhǎng)量明顯高于對(duì)照組。第12天達(dá)到峰值?？梢?jiàn)水楊酸提高多糖的產(chǎn)量與其促進(jìn)菌種生長(zhǎng)有關(guān)。整個(gè)培養(yǎng)期，茉莉酸甲酯對(duì)菌體的生長(zhǎng)量沒(méi)有明顯影響，其處理組與對(duì)照組沒(méi)有差異。說(shuō)明茉莉酸甲酯促進(jìn)多糖產(chǎn)量不是通過(guò)促進(jìn)安絡(luò)小皮傘的生長(zhǎng)，而是以調(diào)節(jié)相關(guān)的代謝過(guò)程促進(jìn)多糖的生成。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，水楊酸和茉莉酸甲酯都可使安絡(luò)小皮傘菌胞內(nèi)外的多糖產(chǎn)量明顯提高；水楊酸可促進(jìn)安絡(luò)小皮傘菌生物量增加，茉莉酸甲酯對(duì)安絡(luò)小皮傘菌生物量沒(méi)有影響，該結(jié)果為水楊酸和茉莉酸甲酯應(yīng)用于液態(tài)發(fā)酵提高真菌多糖產(chǎn)量提供了科學(xué)依據(jù)。