吳立剛 馮慧敏,2 納莉 王丹妮,2 曹佳,2 金曉菲 王立斌,2
1寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院(銀川750001);2寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院(銀川750001)
乳腺癌是女性腫瘤發(fā)病率和病死率較高的疾病之一,發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[1-2]。目前,臨床上一些血清學(xué)標(biāo)志物如糖類蛋白153(carbohydrate antigen 153,CA153)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、糖類蛋白125(carbohydrate antigen 125,CA125)、糖類蛋白199(carbohydrate antigen 199,CA199)、腫瘤特異性生長(zhǎng)因子(tumor-specific growth factor,TSGF)等均可用于協(xié)助診斷乳腺癌[3-4],但對(duì)乳腺癌的臨床診斷不具備特異性。
多效生長(zhǎng)因子(pleiotrophin,PTN)是一個(gè)原癌基因,其表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量為18 kDa的蛋白質(zhì),對(duì)肝素表現(xiàn)出高度親和力[5-6];有多種生物學(xué)功能,如促細(xì)胞有絲分裂、促血管生成、促細(xì)胞增殖、遷移、浸潤(rùn)等,在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)[7]。已有研究[8]顯示,PTN 可用于小細(xì)胞肺癌的診斷以及預(yù)后判斷。但PTN 與乳腺腫瘤的相關(guān)性研究目前尚不多見。本研究通過(guò)檢測(cè)PTN 在乳腺癌患者血清及組織中的表達(dá),探討PTN 在乳腺癌診斷、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及預(yù)后中的價(jià)值,為進(jìn)一步研究其具體作用機(jī)制,尋找新的乳腺腫瘤診斷標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1 一般資料采集2016年4月1日至2018年5月10日寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤科收治的113 例女性乳腺癌患者的血樣?;颊咂骄挲g59.5 歲;其中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移25 例,無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移88 例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移77 例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36 例;Ⅰ~Ⅱ期患者組63 例,Ⅲ~Ⅳ期患者組50 例。術(shù)后病理結(jié)果高分化者76 例,低分化者37 例。組織樣本納入標(biāo)準(zhǔn):(1)乳腺癌經(jīng)過(guò)術(shù)后病理學(xué)的證實(shí);(2)標(biāo)本采集前,患者未接受過(guò)放療、化療等。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患者有其他惡性腫瘤;(2)患者存在免疫性或炎癥性疾??;(3)患者存在代謝性疾病如高血脂、高血壓、糖尿病等,以及肝腎功能不全;(4)患者存在其他手術(shù)禁忌證等。所有樣本在取材前均與患者簽署知情同意書。同時(shí)收集乳腺良性病變患者血液樣本32 例,其中乳腺纖維腺瘤24 例,乳腺囊性增生5 例,乳腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤3 例,以及同期在醫(yī)院體檢中心體檢的健康女性志愿者血液樣本40 例。同時(shí)收集手術(shù)切除的乳腺癌組織10 例,以距離癌組織5 cm之內(nèi)的癌旁乳腺組織標(biāo)本作為對(duì)照。
1.2 主要試劑ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢基因美科技有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa 公司);Trizol(美國(guó)Invitrogen 公司);引物(上海生工基因有限公司);BCA 蛋白定量試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);兔抗人PTN 抗體,兔抗人GAPDH 抗體,HRP 標(biāo)記羊抗兔抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology 公司);癌胚抗原定量測(cè)定試劑盒,糖類抗原125 測(cè)定試劑盒,糖類抗原153 測(cè)定試劑盒(上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)。超凈工作臺(tái)(新加坡ESCO 公司),酶標(biāo)儀(美國(guó)Promega 公司),臺(tái)式低溫高速型離心機(jī)(美國(guó)Thermo 公司),微量移液器(美國(guó)Eppendorf 公司),熒光定量PCR儀(美國(guó)Roche 公司)。
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 ELISA 法檢測(cè)血清PTN 表達(dá)收集受試者空腹靜脈血3 mL,室溫3 500 r/min 離心10 min,分離血清,取PTN 檢測(cè)試劑盒,依次加入樣品稀釋液(40 μL)、待測(cè)樣本(10 μL)和酶標(biāo)試劑(50 μL),封板;37 ℃溫浴30 min;小心揭掉封板膜,迅速甩去液體,拍干,加入洗滌液緩慢震蕩,洗去多余的酶標(biāo)試劑,反復(fù)操作5 次后拍干;分別加入顯色劑A 和B 各50 μL,37 ℃避免光照顯色10 min;加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定樣本的吸光度OD值(450 nm 波長(zhǎng)下)。梯度稀釋的人重組PTN細(xì)胞因子設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.2 RT-PCR檢測(cè)PTN mRNA水平使用TRIzol法提取組織中的總RNA,然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)(PrimeScript RT reagent Kit),獲得cDNA,反轉(zhuǎn)錄體系20 μL(其中包括1 μL 總RNA,1 μL random primer,10 μL ddH2O,2 μL dntp,1 μL RNA 酶抑制劑,4 μL Reaction buffer,1 μL 反轉(zhuǎn)錄酶);反轉(zhuǎn)錄條件為:25 ℃5 min;42 ℃60 min,70 ℃5 min。取各組cDNA,使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ在Light-Cycler480II 定量平臺(tái)以GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行Realtime PCR 實(shí)驗(yàn)。PTN 引物:前引物-GCTGCCTTCTTGGCATTCAT,后引物-CACTCCACTGCCATTCTCCA;GAPDH的引物:前引物-TGAAGGTCGGAGTCAACGGA,后引物-GCGTCAAAGGTGGAGGAGTG。反應(yīng)體系為:1 μL 模板cDNA,0.5 μL + 0.5 μL 上下游引物,8 μL ddH2O,10 μL SYBR MIX,總體積20 μL;PCR條件為:94 ℃30 s;94 ℃5 s,60 ℃30 s,72 ℃20 s,40 個(gè)循環(huán);65 ℃5 s。最后計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。
1.3.3 Western Blot 檢測(cè)PTN 蛋白表達(dá)使用總蛋白抽提試劑盒提取各組織總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,然后取20 μg的蛋白上樣,行SDS-PAGE 電泳分離蛋白,電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上。用含5%脫脂奶粉/1×TBST的封閉液封閉3 h后,加入兔抗PTN抗體一抗(1∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜,1×TBST 清洗3 次,每次15 min,清洗后加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶10 000),IgG 二抗(1∶500),平板搖床50 r/min 孵育2 h,1×TBST 清洗,ECL 發(fā)光檢測(cè),使用多色熒光凝膠成系統(tǒng)曝光后觀察條帶。實(shí)驗(yàn)得到的蛋白條帶采用Image J 軟件進(jìn)行定量分析。
1.3.4 電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)樣本血漿中CEA、CA125和CA153 表達(dá)抽取患者禁食12 h 以上的空腹抗凝靜脈血3 ~5 mL,3 500 r/min 離心10 min,分離血漿,使用Cobas E602 全自動(dòng)免疫分析儀檢測(cè)血漿中CEA、CA125 和CA153 含量。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,采用t-test 以及單因素方差分析;以假陽(yáng)性率為橫坐標(biāo),真陽(yáng)性率為縱坐標(biāo)繪制受試者工作特征曲線(ROC 曲線),根據(jù)約登指數(shù)確定PTN 及CA153、CEA、CA125的最佳截?cái)嘀担容^它們?cè)\斷乳腺癌的敏感性與特異性高低差異以及四項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)乳腺癌的能力。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 各組血清PTN 表達(dá)水平比較分別測(cè)定乳腺癌患者(113 例)、乳腺良性病變患者(32 例)及健康體檢者(40例)血清PTN表達(dá)水平,結(jié)果顯示:乳腺癌患者組血清PTN 表達(dá)水平(573±164.3)pg/mL高于乳腺良性病變組(338.1 ± 130)pg/mL 和健康對(duì)照組(296.6 ± 86.5)pg/mL(t=-8.4,P<0.05;t=13.2,P<0.05),乳腺良性病變組和健康對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.56,P>0.05)。
2.2 乳腺癌組織及癌旁正常組織中PTN 基因表達(dá)差異運(yùn)用Real Time-PCR的方法檢測(cè)了乳腺癌組和癌旁正常組織中PTN mRNA的表達(dá)量,結(jié)果顯示:乳腺癌組織PTNmRNA 表達(dá)量高于癌旁正常組織,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖1-3)。
圖1 PTN 基因和內(nèi)參β-actin 基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 溶解曲線圖Fig.1 Dissolution curve of RT-PCR of the PTN and β-actin gene
圖2 Real Time-PCR 檢測(cè)乳腺癌及癌旁正常組織中PTN基因的表達(dá)Fig.2 Expression of PTN gene in breast cancer and adjacent normal tissues detected by Real Time-PCR
2.3 乳腺癌組織及癌旁正常組織中PTN 蛋白的表達(dá)差異用Western Blot 法分別檢測(cè)乳腺癌組織及癌旁正常組織中PTN 蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:相比于癌旁正常組織,乳腺癌組織中PTN 蛋白表達(dá)量明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4 ~5)。
2.4 PTN 與乳腺癌患者臨床病例特征相關(guān)性分析結(jié)合患者臨床病理資料分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PTN的表達(dá)水平與乳腺癌患者TNM 分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及腫瘤分化有關(guān)(P<0.05)。但乳腺癌患者血清PTN的表達(dá)不受患者的年齡因素、淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移與否、激素(ER、PR、HER2)表達(dá)水平高低、瘤體直徑大小、是否三陰性乳腺癌的影響,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表1)。
圖3 乳腺癌組織及癌旁組織PTN mRNA 表達(dá)差異Fig.3 Differences in PTN mRNA expression in breast cancer tissues and adjacent tissues
圖4 Western Blot 檢測(cè)乳腺癌組織及癌旁正常組織中PTN蛋白表達(dá)差異Fig.4 Differences in PTN protein expression in breast cancer tissues and adjacent normal tissues detected by Western Blot
圖5 PTN 蛋白灰度值計(jì)算統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.5 Statistical results of PTN protein grayscale calculation
2.5 比較PTN、CA153、CEA、CA125 對(duì)乳腺癌的診斷效能差異以假陽(yáng)性率為橫坐標(biāo),真陽(yáng)性率為縱坐標(biāo)繪制ROC 曲線,根據(jù)約登指數(shù)確定最佳截?cái)嘀担≒TN:417.5 pg/mL,CA153:22.5 ng/mL,CEA:3.15 ng/mL,CA125:21.7 ng/mL),PTN 對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值最高,曲線下面積(AUC)為0.893,其敏感度(Sen)和特異度(Spe)分別為76.7%和77.8 %,陽(yáng)性似然比(PLR)為0.848,陰性似然比(NLR)為0.7 診斷比值比(DOR)為12.98。PTN 蛋白聯(lián)合CA153、CEA、CA125 診斷乳腺癌的AUC 為0.99(95%CI:0.98 ~1.00),敏感度為96.1%,特異度為98.6%,均高于單獨(dú)檢測(cè)價(jià)值(圖6、表2)
圖6 各指標(biāo)診斷乳腺癌的ROC 曲線Fig.6 ROC curve of the diagnosis of breast cancer by each indicator
表1 血清PTN 蛋白表達(dá)與乳腺癌患者不同臨床特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between serum PTN protein expression and different clinical characteristics of breast cancer patients ±s
表1 血清PTN 蛋白表達(dá)與乳腺癌患者不同臨床特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between serum PTN protein expression and different clinical characteristics of breast cancer patients ±s
項(xiàng)目年齡<50 歲≥50 歲腫瘤大小≤2 cm>2 cm淋巴轉(zhuǎn)移有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有無(wú)TNM 分期Ⅲ期Ⅳ期Ⅰ+Ⅱ期Ⅲ+Ⅳ期分化高分化低分化ER 表達(dá)陽(yáng)性陰性PR 表達(dá)陽(yáng)性陰性HER2陽(yáng)性陰性類型三陰性非三陰性例數(shù)60 53 44 69 77 36 88 25 30 20 63 50 76 37 58 55 85 28 59 54 17 96 PTN(pg/mL)653.1±115.7 706.9±123.8 635.5±99.6 584.2±138.1 678.4±141.0 599.7±143.3 728.1±131.5 612.6±109.7 632.7±110.3 749.7±124.6 599.1±119.2 702.9±129.4 572.26±75.72 671.54±106.93 600±126.6 582.5±194.3 605.6±132.1 580±156.5 597.3±146.6 590.1±160.8 691±158.6 672.1±133.5 F/t 值-1.306 1.123 1.481 2.384-1.860-2.487-2.577 0.259 0.442 0.105 0.335 P 值0.200 0.271 0.147 0.020 0.086 0.018 0.017 0.798 0.662 0.918 0.741
對(duì)乳腺癌的臨床診斷,除了影像學(xué)資料之外,血清腫瘤標(biāo)志物也在一定程度上提高了乳腺癌的臨床診斷準(zhǔn)確率。
PTN 作為分泌性的生長(zhǎng)因子,除了具有促血管生成、參與胚胎發(fā)育、參與炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)功能,還參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9]。研究發(fā)現(xiàn),PTN在胰腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá),且與嗜神經(jīng)侵襲、肝轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間縮短密切相關(guān)[10]。在乳腺癌中PTN不但可以促進(jìn)乳腺腫瘤血管生成,還可通過(guò)重塑腫瘤細(xì)胞微環(huán)境來(lái)促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)而轉(zhuǎn)移[11-12]。PTN 亦在肝癌、腦膠質(zhì)瘤等癌癥中呈現(xiàn)出高表達(dá)[13-14]?,F(xiàn)已證實(shí),PTN主要通過(guò)與其受體結(jié)合,激活下游多條信號(hào)通路,破壞細(xì)胞間黏附能力,影響細(xì)胞骨架的穩(wěn)定,從而發(fā)揮其生物學(xué)功能,促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[11]。
表2 PTN、CA153、CEA、CA125 對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值比較Tab.2 The diagnostic value of PTN,CA153,CEA and CA125 in breast cancer
本研究證實(shí)乳腺癌患者血清中PTN 蛋白水平高于乳腺良性病變組和健康對(duì)照組血清中PTN的含量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。RT-PCR、Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與癌旁正常組織相比,在乳腺癌組織中PTN mRNA 呈現(xiàn)高表達(dá),且PTN 蛋白表達(dá)水平也同樣較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明PTN 可能參與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。結(jié)合乳臨床病理資料分析顯示:有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Ⅲ+Ⅳ期、分化程度低的患者其血清PTN 濃度越高,說(shuō)明血清中PTN 蛋白水平與乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM 分期、分化程度有關(guān)。推測(cè)PTN 在乳腺癌的發(fā)生和侵襲中可能發(fā)揮重要作用,檢測(cè)血清PTN 水平有助于評(píng)估乳腺癌的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后情況。
腫瘤標(biāo)志物對(duì)腫瘤的輔助診斷、治療效果監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估具有重要價(jià)值。有報(bào)道CA153 在監(jiān)測(cè)乳腺癌術(shù)后有、無(wú)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值上欠佳,但術(shù)前CA153的水平可作為早期乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立因素[15]。CEA單獨(dú)檢測(cè)乳腺癌時(shí)靈敏度較低,常和其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)[16-17]。CA125 是女性生殖系統(tǒng)常用的腫瘤標(biāo)志物,其表達(dá)水平受很多因素的影響,如異位妊娠、冠心病心力衰竭等。本研究檢測(cè)了乳腺癌患者、乳腺良性病變者以及健康體檢者外周血中PTN、CA153、CEA、CA125的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PTN 診斷乳腺癌的曲線下面積最大,且敏感性較其他3 種腫瘤標(biāo)志物高,但PTN 診斷乳腺癌的特異度較CA153 低。PTN 聯(lián)合CA153、CEA和CA125 診斷乳腺癌的AUC 較單獨(dú)檢測(cè)時(shí)明顯增大。綜上所述,檢測(cè)血清PTN 水平有助于評(píng)估乳腺癌的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后情況,與CA153、CEA 以及CA125聯(lián)合檢測(cè)可明顯提高對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值。
由于樣本量的限制,本研究對(duì)乳腺癌組織中PTN 表達(dá)與臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)之間的關(guān)系分析未能進(jìn)行深入研究。對(duì)PTN 與乳腺腫瘤發(fā)展的分子機(jī)制的進(jìn)一步明確,還需后續(xù)開展深入研究及結(jié)合大樣本的臨床資料進(jìn)行分析總結(jié)。