毛海清 袁夢(mèng)婷 張鵬道 龍籍由 唐子茜 袁曉玉 于春偉

(海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 海南?？?71199)

香蕉枯萎病是世界香蕉產(chǎn)區(qū)的重要病害，在我國廣東、廣西、福建、海南、臺(tái)灣等部分香蕉種植區(qū)嚴(yán)重發(fā)生［1］。研究表明，香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌侵染香蕉根部所引起的一種土傳性維管束病害［2-3］。目前，香蕉枯萎病主要防控措施有選育抗病品種［4］、化學(xué)藥劑［5-6］、作物輪作［7-8］、生物防治［9-10］、分子遺傳改良［11-12］等?；诳共∑贩N產(chǎn)量普遍不佳［13］，而大多拮抗菌抑制作用不強(qiáng)，普及推廣范圍較?。?］?；瘜W(xué)防治盡管對(duì)環(huán)境有一定的污染，但作為一種簡(jiǎn)單、快速、低成本的防治方式，在香蕉的生產(chǎn)實(shí)踐中仍具有重要的指導(dǎo)意義。

席夫堿是一類含甲亞胺基或亞胺基的有機(jī)化合物，能通過配位共價(jià)鍵和很多金屬離子形成配合物，在抑菌、抗腫瘤、抗病毒等方面表現(xiàn)出驚人的藥理活性。江峰等［14］研究表明，殼聚糖香草醛席夫堿對(duì)獼猴桃果汁中分離到4株污染菌分別為枝孢菌、歧皺青霉菌、雜色曲霉菌、堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌具有明顯的抑制效果。江璽等［15］以殼聚糖等為原料，經(jīng)過縮合反應(yīng)得到四種殼聚糖席夫堿衍生物，通過微量液體稀釋法和真菌菌絲生長速率法測(cè)定4種衍生物對(duì)灰霉菌均有明顯抑制作用。曾利等［16］合成的菲醌-甘氨酸希夫堿金屬配合物，對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)一定的抑制作用。隨著人們對(duì)席夫堿類化合物抗菌活性的了解，關(guān)于席夫堿殺菌抗菌活性方面的性能研究也將越來越受到重視。本研究擬合成基于苯甲酰肼的新型席夫堿化合物，并對(duì)其與金屬絡(luò)合后對(duì)香蕉枯萎病菌的抗菌活性進(jìn)行研究，設(shè)計(jì)合成對(duì)尖孢鐮刀菌抑菌活性良好的席夫堿衍生物，以期為海南香蕉枯萎病的化學(xué)防治提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

尖孢鐮刀菌生理4號(hào)小種（Foctropical race 4，F(xiàn)ocTR4）（由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供）。

1.1.2 試劑

DMSO（阿拉丁）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（青島海博）、鄰氨基苯甲酰肼（阿拉?。⒁掖迹ㄎ麟]科學(xué)）、2-噻吩甲醛（阿拉?。?、2-吡啶甲醛（阿拉?。?、水楊醛（阿拉丁）、甲醇（百靈威）、氯化汞（天津利密歐）、氯化銅（天津利密歐）、硝酸鋅（天津利密歐），以上試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 化合物的合成路線

在理論計(jì)算和分子識(shí)別指導(dǎo)下，有針對(duì)性地進(jìn)行設(shè)計(jì)，并利用組合化學(xué)的相關(guān)知識(shí)篩選有效化合物，選擇設(shè)計(jì)合成3種席夫堿化合物，并將之分別對(duì)應(yīng)的與3種金屬離子絡(luò)合。合成路線如圖1。

圖1 化合物 11～ 66的合成路線

1.2.2 系列一化合物的合成

分別稱量0.491 4、0.501 1、0.486 6 g鄰氨基苯甲酰肼加入3個(gè)已有40 mL乙醇的100 mL規(guī)格的單口燒瓶中，加入磁子攪拌，再分別加入2-噻吩甲 醛（727.76 μL， 7.80 mmol）、 2-吡 啶 甲 醛（772.38 μL，7.96 mmol）、水楊醛（822.72 μL，7.73 mmol），緩慢升溫至75oC左右，攪拌回流8 h，冷卻反應(yīng)溶液，旋轉(zhuǎn)蒸干乙醇。加入少量水，此時(shí)溶液渾濁出現(xiàn)大量沉淀，抽濾，水洗濾餅3次，真空干燥，依次得到目標(biāo)產(chǎn)物。

化合物1：淡黃色。MS（ES+）m/z：336.18［M+1］+.1H NMR（δ：ppm，CDCl3）：8.98（s，1H），8.68（d，1H，J＝5.00），8.67（d，1H，J＝5.00），8.08（d，1H，J＝8.00），8.00（d，1H，J＝8.00），7.73（t，1H，J＝7.50），7.60（t，1H，J＝7.77），7.28（t，3H，J＝7.02），7.20（t，1H，J＝6.28），6.88（t，1H，J＝7.40），6.72（d，1H，J＝8.45），6.38（s，1H），5.85（s，1H）.13C NMR（δ：ppm，CDCl3）：161.33，158.64，155.91，150.27，149.97，149.53，145.24，137.01，136.45，134.29，129.13，124.28，121.24，120.74，119.84，116.19，115.37.

化合物2：黃色。MS（ES+）m/z：329.06［M］+.1H NMR（δ：ppm，CDCl3）：9.04（s，1H），8.63（d，1H，J＝5.00），8.61（d，1H，J＝5.00），8.04（d，1H，J＝8.00），8.00（d，1H，J＝8.00），7.73（t，1H，J＝7.50），7.60（t，1H，J＝7.75），7.28（t，3H，J＝7.00），7.20（t，1H，J＝6.25），6.86（t，1H，J＝7.50），6.70（d，1H，J＝8.50），6.37（s，1H），5.83（s，1H）.13C NMR（δ：ppm，CDCl3）：161.33，157.64，153.91，150.27，149.97，149.53，145.24，137.01，136.45，134.29，129.13，124.28，123.45，121.24，120.74，119.82，116.15，115.35.

化合物3：白色。MS（ES+）m/z：360.20［M+H］+，382.31［M+Na］+.1H NMR（δ ppm，DMSO-d6）：11.44（s，1H），10.24（s，1H），8.45（s，1H），7.80（d，1H，J＝7.72），7.48（s，1H），7.39（d，1H，J＝7.40），7.30（d，1H，J＝7.12），7.27（d，1H，J＝7.20），7.13（t，1H，J＝7.38），6.97（d，1H，J＝7.60），6.92（d，1H，J＝7.32），6.89（s，1H），6.87（d，1H，J＝7.64），6.83（d，1H，J＝7.56），6.76（d，1H，J＝7.36），6.72（d，1H，J＝10.24），6.68（d，1H，J＝7.48）.13C NMR（δ ppm，DMSO-d6） ：161.21，158.51，155.63，150.64，147.28，135.14，132.50，131.38，130.78，129.00，126.90，125.08，120.12，119.93，119.24，118.54，117.48，116.75，115.79，114.11.

1.2.3 系列二化合物的合成

分別將71.8 mg的化合物1（339.47 g/mol）、化合物 2（329.47 g/mol）、化合物 3（359.47 g/mol）溶于15 mL甲醇中，置于25 mL容量瓶中，再分別加入 HgCl2（0.1183 g，4.36 mmol）、CuCl2·2H2O （0.0743 g， 4.36 mmol）、 Zn （NO3）2·6H2O（0.1188 g，3.99 mmol），抽濾，水洗濾餅3次，真空干燥，依次得到系列二化合物4（淡黃色）、化合物5（綠色）、化合物6（白色）。

1.2.4 體外抗真菌活性測(cè)試

抗菌劑的配制：離心管滅菌后對(duì)應(yīng)相應(yīng)藥品的編號(hào)，用天平稱取0.01 g藥品，分別投加到相應(yīng)的離心管，在無菌操作臺(tái)，用微量注射器加入1 mL DMSO，搖勻，用封口膜封好，存放冰箱待用。

帶毒培養(yǎng)基的配制：滅菌后的培養(yǎng)基待溫度降至60℃左右時(shí)，在無菌工作臺(tái)中用無菌槍頭加入抗菌劑至培養(yǎng)基，輕輕振蕩搖勻制成4 mg/100 mL的帶毒培養(yǎng)基，倒入直徑為9 cm的無菌平板中，并在平板上做好相應(yīng)編號(hào)，空白對(duì)照只加DSMO試劑，平板放靜置0.5 h待完全冷卻后，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)24 h，備用。

接種培養(yǎng)：在無菌操作臺(tái)中用滅菌好的直徑5 mm打孔器對(duì)生長好的尖孢鐮刀菌生理4號(hào)小種平板進(jìn)行打孔，隨后用無菌鑷子將菌餅接種到帶毒平板和空白對(duì)照平板上，并記錄接種時(shí)間。將接種好的平板放在28℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)。

結(jié)果記錄：平板培養(yǎng)72、96、120 h后分別量取菌落直徑（按十字交叉法，每個(gè)菌落量2次，取其平均數(shù)），同時(shí)拍照記錄。

將處理菌落和空白組進(jìn)行直徑對(duì)比，求得抑制百分率。

2 結(jié)果與分析

2.1 系列一衍生物對(duì)尖孢鐮刀菌生理4號(hào)小種的抗菌活性研究

合成的1～3號(hào)化合物物對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果如圖2所示，在菌落生長初期，殺菌劑對(duì)菌的抑制效果較好，隨著時(shí)間的推移，抑制效果降低。在72 h時(shí)，化合物1、2、3抗菌效果最好，分別達(dá)到14.7%、10.7%、16.0%，而96、120 h則有所下降并基本保持穩(wěn)定，且能保持持久的作用效果，這種現(xiàn)象可能是由于尖孢鐮刀菌生理4號(hào)小種在5 d左右基本長成?？傮w來說，化合物3號(hào)對(duì)尖孢鐮刀菌生理4號(hào)小種抑制效果最好，化合物1號(hào)次之，化合物2號(hào)也有一定的抗菌效果，1、2號(hào)抗菌活性不是很高，原因可能是2-噻吩甲醛、2-吡啶甲醛分別具有S-、N-，以及醛基等吸電子基團(tuán)，使得抑菌效果不明顯。綜上所述，系列一衍生物對(duì)尖孢鐮刀菌生理4號(hào)小種的最佳抗菌條件在投藥72 h后，抗菌劑濃度為4 mg/100 mL時(shí)，3種抗菌劑對(duì)尖孢鐮刀菌生理4號(hào)小種的抑制率依次為：化合物3號(hào)＞1號(hào)＞2號(hào)。

2.2 系列二衍生物對(duì)尖孢鐮刀菌生理4號(hào)小種的抗菌活性研究

從圖3數(shù)據(jù)可以看出，系列一衍生物在和金屬離子絡(luò)合后所形成的系列二衍生物，在72 h時(shí)抗菌活性較強(qiáng)，隨后有所下降，而在120 h時(shí)開始上升，且抑菌效果最好，可分別達(dá)到12.7%、14.1%、14.1%。其中與鋅離子絡(luò)合而成的化合物6號(hào)對(duì)尖孢鐮刀菌抑制效果最好。相同條件下，72和96 h系列二衍生物抗菌活性均比系列一衍生物要低，而120 h時(shí)則相反，說明在120 h時(shí)間段為該類席夫堿金屬配合物的最佳抑菌活性反應(yīng)時(shí)間。綜上所述，系列二衍生物對(duì)尖孢鐮刀菌生理4號(hào)小種的最佳抗菌條件在投藥120 h后，抗菌劑濃度為4 mg/100 mL時(shí)，3種抗菌劑對(duì)尖孢鐮刀菌生理4號(hào)小種的抑制率依次為：化合物6號(hào)＞5號(hào)＞4號(hào)，添加金屬離子修飾后，抑菌效果沒有顯著增加，后續(xù)需進(jìn)行金屬離子的重新修飾，從而達(dá)到抑菌效果的顯著增加。

圖2 系列一化合物的對(duì)尖孢鐮刀菌生理4號(hào)小種的抗菌活性曲線

圖3 系列二絡(luò)合物的對(duì)尖孢鐮刀菌生理4號(hào)小種的抗菌活性曲線

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

在化學(xué)防治方面，常用的廣譜殺菌劑多菌靈等被報(bào)道在實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)香蕉枯萎病菌都有較好的抑制效果，但田間防治效果較差［17］，此外，楊雙昱等［3］研究表明，戊二醛作為防治香蕉枯萎病菌的土壤消毒劑，對(duì)抑制香蕉枯萎病也具有一定效果，但都局限于盆栽實(shí)驗(yàn)，田間防治效果還有待進(jìn)一步提高。所以，開發(fā)新型的高效化學(xué)殺菌劑，提高其對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌效果顯得迫在眉睫。與市場(chǎng)上成熟的殺菌劑的殺菌效果相比，本研究合成的殺菌劑抑菌效果較差［1］，但席夫堿配合物對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌活性等到證實(shí)。同時(shí)，席夫堿可靈活巧妙的選擇胺類化合物和羰基來反應(yīng)，可通過改變功能基團(tuán)從而實(shí)現(xiàn)衍生化［18］。另外，席夫堿結(jié)構(gòu)中常含有高電負(fù)性的O、S、P等原子，而且甲亞胺上的N原子上有孤對(duì)電子，在一定的條件下容易與金屬形成配合物，而其中的某些配合物具有良好的抗菌、抗腫瘤、抗炎等藥理作用，席夫堿金屬配位化合物所呈現(xiàn)出廣泛的生物活性［19］。下一步將對(duì)合成的席夫堿類衍生物進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化與修飾，以實(shí)現(xiàn)其對(duì)尖孢鐮刀菌高效抑制，為實(shí)現(xiàn)香蕉枯萎病的化學(xué)防治提供支持。

3.2 結(jié)論

本研究合成基于苯甲酰肼的6個(gè)席夫堿化合物，通過菌絲生長抑制試驗(yàn)，考察了其對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌效果，結(jié)果表明6個(gè)新合成的化合物均對(duì)尖孢鐮刀菌有一定的抑制效果。其中3號(hào)化合物對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果最好，4 mg/100 mL濃度下，72 h時(shí)的抑制率達(dá)到16.0%，表現(xiàn)出一定的抑菌活性。