林 妃 李敬陽(yáng) 何應(yīng)對(duì) 王麗霞 黃東梅 殷曉敏 劉永霞 王必尊

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站/海南省香蕉健康種苗繁育工程技術(shù)研究中心 海南?？?71101)

地瓜又名白薯、甘薯、山芋、紅芋、番薯、紅薯，為旋花科甘薯屬一年生或多年生蔓性草本植物，富含蛋白質(zhì)、淀粉、果膠、纖維素及多種礦物質(zhì)，有“長(zhǎng)壽食品”之譽(yù)，是重要的糧食、飼料和工業(yè)原料用作物，在世界糧食生產(chǎn)總產(chǎn)量中排列第7位［1-3］。澄邁橋頭富硒地瓜可以說(shuō)是地瓜屆的王者，它還有一個(gè)雅號(hào)—“長(zhǎng)壽瓜”，其富含各種維生素、膳食纖維、淀粉、鉀、鈣等物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)豐富，甜度適中，且含硒元素特別高，可補(bǔ)虛、健脾、抗胃癌，是地瓜中的珍品，備受喜愛(ài)。

甘薯是中國(guó)重要的農(nóng)作物，年產(chǎn)量?jī)H次于水稻、小麥和玉米。然而，甘薯病毒病卻一直影響著甘薯的產(chǎn)量，極大地阻礙了甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，中國(guó)每年因甘薯病毒病造成的產(chǎn)量損失價(jià)值高達(dá)40億元，此問(wèn)題一直困擾著很多從事此方面研究的科技人員。甘薯病毒有多種，其中，甘薯卷葉病 毒 （sweetpotato leaf curl virus， 簡(jiǎn) 稱SPLCV）是引起甘薯產(chǎn)量大幅降低的主要病原之一，SPLCV可引起甘薯葉片上卷、植株矮化等，在自然條件下由昆蟲(chóng)介體煙粉虱通過(guò)持久方式進(jìn)行傳播，也可通過(guò)嫁接方式進(jìn)行傳播［4-5］。

地瓜為無(wú)性繁殖作物，主要通過(guò)蔓秧、種薯和苗繁殖，病毒易在體內(nèi)積累，從而逐年加重，造成減產(chǎn)，與其它無(wú)性繁殖作物一樣，其產(chǎn)量受到病毒病的嚴(yán)重威脅。病毒病大田發(fā)病率達(dá)40%～60%，造成減產(chǎn)15%以上，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%～80%，且有加重與蔓延的趨勢(shì)［6～8］。目前對(duì)植物病毒病尚無(wú)有效的防治藥劑，應(yīng)用植物莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)脫毒苗是防治病毒病最有效的途徑。國(guó)內(nèi)外的研究表明，甘薯通過(guò)莖尖培養(yǎng)獲得脫毒苗，能顯著提高產(chǎn)量［9-11］，增幅在 14.6%～43.4%［12］，并能改善塊莖品質(zhì)［13］和品種的特性。近年來(lái)，澄邁橋頭地瓜由于受病毒病的影響，產(chǎn)量嚴(yán)重下降，舊地不能繼續(xù)種植地瓜，大幅縮小橋頭地瓜的種植面積。解決澄邁橋頭地瓜種苗脫毒問(wèn)題是確保地瓜產(chǎn)量提高的有效途徑。試驗(yàn)選取海南省澄邁橋頭地瓜作為供試品種，開(kāi)展澄邁橋頭富硒地瓜脫毒苗繁殖技術(shù)的研究，為澄邁橋頭地瓜脫毒苗工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站熱帶植物繁殖技術(shù)研究中心進(jìn)行。

1.1.2 試驗(yàn)材料

選取無(wú)病蟲(chóng)害、表面光滑無(wú)損傷的海南澄邁橋頭富硒地瓜（簡(jiǎn)稱橋頭地瓜）為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體準(zhǔn)備

將采回的橋頭地瓜置于26℃左右環(huán)境下催芽，待芽萌發(fā)至5～8 cm時(shí)將芽剪下，剪去已展開(kāi)的葉片，留下3 cm左右的頂芽。

1.2.2 外植體消毒

將頂芽用洗衣粉水清洗一遍，自來(lái)水沖洗30 min，置于無(wú)菌操作臺(tái)備用。在無(wú)菌操作臺(tái)上先用無(wú)菌水清洗2～4遍，把水倒干，放入75%酒精里不停搖晃1 min；用無(wú)菌水清洗2～4遍，再置于0、1‰、2‰、3‰的升汞溶液中浸泡15 min，不時(shí)搖晃，然后用無(wú)菌水清洗3～5遍，備用。

1.2.3 地瓜莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)

將消毒好的頂芽去掉葉片、莖段枝條，取莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)快速接種到含不同濃度激素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)（表1）。以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度激素6-B、IBA，每種培養(yǎng)基接種50個(gè)外植體，置于26～30℃暗培養(yǎng)5 d，轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)，每天光照12～14 h。

表1 不同莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方

1.2.4 繼代培養(yǎng)

將莖尖誘導(dǎo)出來(lái)的橋頭地瓜脫毒苗用Frison等［14-15］的方法證明為無(wú)毒組培苗，將其作為繼代培養(yǎng)材料。切取帶芽的脫毒苗莖段接種到繼代培養(yǎng)基中（配方為誘導(dǎo)莖尖篩選的培養(yǎng)基：MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L）；置于25～28℃條件下暗培養(yǎng)5～7 d，之后在光照14h/d、光強(qiáng)度1 500～1 800 lx條件下培養(yǎng)。

1.2.5 壯苗生根試驗(yàn)

待繼代培養(yǎng)脫毒苗長(zhǎng)至3 cm左右高時(shí)，切取單苗接種到含不同濃度激素的培養(yǎng)基上，置于光照16h/d、光強(qiáng)度1 500～1 800 lx條件下培養(yǎng)，觀察橋頭地瓜單芽在不同濃度激素中的壯苗生根情況。不同生根培養(yǎng)基以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，分別添加0、0.1、0.2、0.3 mg/L NAA。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同升汞濃度對(duì)橋頭地瓜頂芽消毒的影響

由表2可見(jiàn)，2‰的升汞消毒效果最佳，其污染率最低（15%），褐化率較低（18%）；對(duì)照污染率100%；升汞濃度為1‰時(shí)褐化率最低，但是污染率達(dá)到65%；升汞濃度為3‰時(shí)污染率最低（10%），但褐化嚴(yán)重，達(dá)到63%。綜合考慮，將2‰升汞濃度作為橋頭地瓜外植體最適宜消毒濃度。

2.2 不同濃度6-BA對(duì)橋頭地瓜莖尖誘導(dǎo)的影響

將消毒好的地瓜頂芽去掉多余的葉片及莖段，留取莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，分別接種到A1、A2、A3和A4誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每天觀察記錄試驗(yàn)情況。第10天時(shí)A2和A3誘導(dǎo)出1～2個(gè)新芽，A1沒(méi)有新芽，A4外植體周?chē)杏鷤纬桑珹5外植體周?chē)纱罅康挠鷤５?5天時(shí)A1培養(yǎng)基中的外植體形成單芽，誘導(dǎo)率達(dá)到76%（表3）；A2培養(yǎng)基中的外植體長(zhǎng)出1～5個(gè)新芽，誘導(dǎo)率達(dá)到83%；A3培養(yǎng)基中外植體誘導(dǎo)出5個(gè)以上的新芽，誘導(dǎo)率達(dá)到100%；A4培養(yǎng)基中外植體愈傷組織膨大，形成的叢生芽數(shù)量多，加上愈傷多，難以形成植株，誘導(dǎo)率只有43%；A5培養(yǎng)基中外植體形成大量愈傷并褐化，誘導(dǎo)率低，只有23%，難以形成植株（圖1）?？梢?jiàn)最適合地瓜莖尖誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為A3，不加激素的情況下（對(duì)照）地瓜莖尖只有單芽形成，隨著激素6-BA濃度的升高，誘導(dǎo)的叢生芽增多，而激素6-BA濃度過(guò)高時(shí)叢生芽雖多，愈傷也多，難以形成單芽植株。因此，并不是激素6-BA濃度越高越好。試驗(yàn)證明，最合適橋頭地瓜莖尖誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為A3。

表2 不同濃度升汞對(duì)莖尖消毒的影響

表3 不同濃度6-BA對(duì)橋頭地瓜莖尖誘導(dǎo)的影響

圖1 不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)地瓜莖尖叢生芽

2.3 繼代培養(yǎng)

將莖尖誘導(dǎo)出來(lái)的橋頭地瓜組培苗用Frison等［14-15］的方法檢驗(yàn)，證明其為無(wú)毒組培苗后，將其作為繼代培養(yǎng)材料。切取小苗帶芽莖段接種到繼代培養(yǎng)基中，7 d左右有大量叢生芽形成，15 d左右長(zhǎng)成3～5 cm的單個(gè)植株，即可用于生根培養(yǎng)。

2.4 不同濃度NAA對(duì)橋頭地瓜組培苗壯苗生根的影響

誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基以1/2 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加激素為NAA，設(shè)計(jì)4個(gè)濃度水平。地瓜為草本植物，生根容易。不添加激素的情況下（對(duì)照），地瓜組培苗也能生根，但生根時(shí)間長(zhǎng)，10 d后才開(kāi)始有根形成。添加激素NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，第3天就開(kāi)始有根長(zhǎng)出，7 d左右形成大量的根，苗粗壯，10～12 d就能連苗移栽；添加激素NAA濃度為0.2 mg/L時(shí)，3 d后有大量根長(zhǎng)出，根的周?chē)杏鷤纬?，造成根的褐化；添加激素NAA濃度為0.3 mg/L時(shí)，5 d后才有根長(zhǎng)出，根蓬松，愈傷多，褐化嚴(yán)重。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)添加激素NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)最合適地瓜組培苗壯苗生根。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)表明，地瓜組培苗在基礎(chǔ)培養(yǎng)基1/2 MS中不添加激素也能生根，與劉玉敬等［5］報(bào)道（甘薯無(wú)毒苗快繁采用無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)就能順利生長(zhǎng)）相同。但是不加激素生根時(shí)間長(zhǎng)，在添加激素NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)最適合生根，生根時(shí)間短，第3天就有根形成，10～12 d就能連苗移栽，苗粗壯，根基部不形成愈傷；添加激素大于0.1 mg/L時(shí)基部有愈傷形成，影響生根時(shí)間及根數(shù)量，且根褐化。激素濃度越高愈傷越多，褐化越嚴(yán)重，這與前人研究結(jié)果相符，即激素濃度相對(duì)降低，可縮短了生根時(shí)間，且節(jié)約了生產(chǎn)成本，更有利于工廠化育苗。

本研究中，澄邁橋頭地瓜莖尖誘導(dǎo)選擇的激素組合為6-BA和IBA，這與顧淼［3］報(bào)道相同，只是所選擇的濃度不同，獲得的誘導(dǎo)率不一致，本研究縮短了莖尖的誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)率高、苗粗壯。本研究結(jié)果證明，用配方A3誘導(dǎo)橋頭地瓜莖尖，15 d就能形成5個(gè)以上的芽，15 d誘導(dǎo)率達(dá)到100%，可用于繼代或生根培養(yǎng)。激素6-BA濃度的高低對(duì)橋頭地瓜莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的誘導(dǎo)有很大的影響，不添加激素，只能誘導(dǎo)成單芽；6-BA濃度在0～2 mg/L，誘導(dǎo)率隨著濃度的增大而提高，叢生芽數(shù)量增多，但是6-BA濃度大于2 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率隨著激素6-BA濃度的增加反而減少，愈傷多，形成植株數(shù)量少。

通過(guò)對(duì)澄邁橋頭地瓜莖尖進(jìn)行誘導(dǎo)試驗(yàn)，獲得了一套澄邁橋頭地瓜脫毒組培苗快速繁殖方法：用2‰升汞對(duì)外植體進(jìn)行消毒；莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)誘導(dǎo)不定芽的最適培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L；繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L；最佳壯苗生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.1 mg/L。