宋學(xué)薇，劉亞梅，孫佳，胡鑫，紀(jì)江海

從2005年到2011年，我國的侵入性胎盤(胎盤植入、增生和萎縮)的發(fā)病率增加了30%。侵入性胎盤的臨床危險(xiǎn)因素包括前置胎盤和子宮手術(shù)史[1-3]。目前，侵入性胎盤的診斷主要依靠產(chǎn)前超聲診斷，尚無母體胎盤或血清標(biāo)志物對侵襲性胎盤具有高度敏感性[4-5]。侵入性胎盤即絨毛膜絨毛直接附著或侵入子宮肌層，在分娩中發(fā)生率為1∶2 500，并且在過去的50年中發(fā)病率增加了10倍。侵入性胎盤的病理學(xué)基礎(chǔ)是蛻膜基底缺損。血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)是分泌的剪接變體，其可結(jié)合循環(huán)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和胎盤生長因子，導(dǎo)致其活性降低，被認(rèn)為在先兆子癇的發(fā)病機(jī)制中起抑制作用[6-7]。血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)屬于細(xì)胞因子可誘導(dǎo)的免疫球蛋白樣(Ig樣)超家族，是結(jié)合白細(xì)胞整聯(lián)蛋白的受體樣膜結(jié)合蛋白。巨噬細(xì)胞-1抗原(Mac-1)和淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)是VCAM-1的配體，且晚期抗原激活-4亦是VCAM-1配體。循環(huán)可溶性細(xì)胞黏附分子由mRNA的交替剪接或膜結(jié)合蛋白形式的蛋白水解產(chǎn)生[8]。由于內(nèi)皮激活，在患有感染、癌癥和自身免疫疾病的患者中發(fā)現(xiàn)VCAM-1水平增加[9-10]。因此，VCAM-1濃度反映了內(nèi)皮細(xì)胞炎性水平。本研究擬探討PECAM-1和VCAM -1在侵入性胎盤組織中的表達(dá)及意義，為侵入性胎盤的早期診斷及治療提供理論及臨床依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2009年2月—2016年12月河北省滄州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科單胎足月妊娠分娩并建立生產(chǎn)檔案的產(chǎn)婦共276例，其中侵入性胎盤138例(植入性胎盤 68例、粘連性胎盤70例)作為侵入性胎盤組，無侵入性胎盤138例作為正常胎盤組。正常胎盤組孕婦年齡22～32(26.9±4.0)歲，BMI 20.1～27.2(23.7±3.1)kg/m2，孕次1～3(1.3±0.4)次，孕期36～40(38.0±2.9)周；侵入性胎盤組年齡22～33(27.1±5.7)歲，BMI 20～26(23.8±3.9)kg/cm2，孕次1～3(1.4±0.3)次，孕期36～41(38.3±3.0)周；2組年齡、BMI、孕次、妊娠周數(shù)等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究得到醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有入選對象均知情同意并簽署知情同意書，自愿提供胎盤組織和血清。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)入組孕婦均未出現(xiàn)全身性疾病，不存在胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩。(2)侵入性胎盤均符合Gielchinsky 2002年提出的侵入性胎盤診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。

排除標(biāo)準(zhǔn)：采用輔助生殖技術(shù)受孕者；近3個(gè)月有手術(shù)、創(chuàng)傷史；排除合并胎膜早破、圍產(chǎn)期心肌病、妊娠期高血壓、糖尿病等病史的產(chǎn)婦；早產(chǎn)胎膜破裂，前置胎盤或產(chǎn)前出血的婦女，有感染證據(jù)(胎盤的組織病理學(xué)檢查)，高血壓疾病或母體合并癥。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 血清及胎盤中PECAM-1和VCAM-1 mRNA表達(dá)水平的測定：使用RNeasy mini試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)從血清及胎盤中提取RNA，并使用Nanodrop ND 1000分光光度計(jì)(NanoDrop technologies Inc，Wilmington，DE)定量，根據(jù)制造商指南，使用Superscript VILO cDNA合成試劑盒(Life Technologies)將0.2 μgRNA轉(zhuǎn)化為cDNA。對PECAM-1和VCAM-1進(jìn)行taqman基因表達(dá)測定。PECAM-1的引物序列：正向引物5'-GGAGGAGGAGATTGAGCACAACA-3'，反向引物5'-AGCGGTACAGCTGCTTGAAC-3'。VCAM-1的引物序列：正向引物5'-CTCCTGCGAAACCTCAGTG-3'，反向引物5'-GACGATGGTGACGTTGATGT-3'。硝酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物序列：正向引物5'-ACAATCAGAGGTGAGCACTGCAA3'，反向引物5'-TCCGAGCCTGAAAGTTAGCAA-3'。使用FAM標(biāo)記的Taqman通用PCR mastermix(Life Technologies)在CFX 384(Bio-Rad，Hercules，CA)上進(jìn)行RT-PCR，運(yùn)行條件：50℃ 2 min；95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min(40個(gè)循環(huán))。反應(yīng)體系為：正向引物10 μl、反向引物10 μl、RNA模版0.6 μl、超級酶混合物0.2 μl、2×μByr。GAPDH作為內(nèi)部對照將所有數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，并針對對照樣品的平均Ct進(jìn)行校準(zhǔn)。利用2-ΔΔCt公式計(jì)算mRNA表達(dá)量。

1.3.2 胎盤中PECAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)水平的測定：將胎盤組織樣品用福爾馬林固定并石蠟包埋。將切片以5 μm切割，脫蠟，在二甲苯中脫蠟，并通過一系列梯度醇再水合。將樣品放入檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中，在微波爐中煮沸20 min以進(jìn)行抗原修復(fù)。用0.3%氫過氧化物酶封閉內(nèi)源性過氧化物酶30 min，然后在5%山羊血清中孵育60 min以防止非特異性抗原。然后將載玻片與第一抗體在4℃溫育過夜。使用以下一抗和稀釋液：用于PECAM-1的小鼠單克隆抗體(AF1086,1∶40;R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)，用于VCAM-1的兔單克隆抗體(ab174838,1∶100;Abcam，Cambridge，UK)及用于PECAM-1和VCAM-1的小鼠單克隆二抗體(ab20034,1∶100;Abcam； CTS 008;R&D Systems)。用Histofine SAB-PO(Nichirei)檢測PECAM-1、VCAM-1二抗抗體結(jié)合。施加與山羊抗小鼠免疫球蛋白綴合的第二過氧化物酶標(biāo)記的聚合物60 min。在3,3-二氨基聯(lián)苯胺中開發(fā)并用Mayer蘇木精復(fù)染。每個(gè)載玻片通過梯度醇脫水并用蓋玻片覆蓋。陽性細(xì)胞的判定由病理科醫(yī)師以盲法確定。PECAM-1、VCAM-1表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)中。染色強(qiáng)度評分：0分，表示無染色；1分，弱染色；2分，中度染色；3分，強(qiáng)染色。細(xì)胞染色細(xì)胞百分比評分： 0分，0～4%細(xì)胞染色；1分，5%～29%細(xì)胞染色；2分，30%～59%細(xì)胞染色；3分，60%～100%。將細(xì)胞染色數(shù)量和染色強(qiáng)度評分的值相乘，得到范圍為0～9的結(jié)果。

1.3.3 血清中PECAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)水平檢測：PECAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定， ELISA試劑盒購自武漢華美生物科技有限公司，嚴(yán)格按照ELISA試劑說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 2組胎盤組織中PECAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平的比較 侵入性胎盤組PECAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平高于正常胎盤組(P<0.01)，見表1。

表1 2組胎盤組織中PECAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平比較

2.2 2組胎盤組織中PECAM-1、VCAM-1 蛋白表達(dá)評分比較 侵入性胎盤組PECAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)評分高于正常胎盤組(P<0.01)，見表2。

表2 2組胎盤組織中PCAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)水平比較

2.3 2組胎盤組織中PECAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)陽性率比較 侵入性胎盤組PECAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)陽性率高于正常胎盤組(P<0.01)，見表3，圖1見封3。

表3 2組胎盤組織中PECAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)陽性率比較 [例(%)]

2.4 2組血清PECAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)比較 侵入性胎盤組血清PECAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平高于正常胎盤組(P<0.01)，見表4。

表4 2組血清PECAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平比較

2.5 2組血清PECAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)水平比較 侵入性胎盤組血清PECAM-1、VCAM-1 蛋白表達(dá)水平高于正常胎盤組(P<0.01)，見表5。

表5 2組血清PECAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

二維和三維彩色多普勒超聲在侵入性胎盤患者的產(chǎn)前診斷中具有82%～100%的靈敏度和92%～97%的特異度。侵入性胎盤的超聲特征包括在胎盤內(nèi)存在不規(guī)則形狀的胎盤腔隙，覆蓋胎盤的子宮肌層變薄，失去雙季節(jié)性“超聲波線”，胎盤向膀胱凸出，增加子宮漿膜—膀胱界面的血管分布。在正常妊娠中，絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵入蛻膜，胎兒來源的內(nèi)皮化滋養(yǎng)層代替母體螺旋小動脈血管內(nèi)皮，導(dǎo)致螺旋動脈重塑為低阻力血管，其通常對血管控制無反應(yīng)。如果滋養(yǎng)細(xì)胞增殖過多，則易發(fā)生胎盤侵襲，通過蛻膜進(jìn)入子宮肌層和鄰近的盆腔器官，在某些情況下導(dǎo)致分娩時(shí)發(fā)生嚴(yán)重出血，威脅母體及胎兒生命。當(dāng)胎盤植入子宮瘢痕血管部位時(shí)，尤易發(fā)生過度侵襲。雖然滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制復(fù)雜，但先前的細(xì)胞培養(yǎng)和免疫組織化學(xué)研究表明PECAM-1可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲。

PECAM-1在先兆子癇中高表達(dá)。早發(fā)性先兆子癇與淺胎盤和胎盤低灌注有關(guān)，導(dǎo)致高PECAM-1表達(dá)，誘導(dǎo)胎盤缺氧和梗死，最終顯現(xiàn)出蛋白尿和高血壓的臨床表型。相反，侵入性胎盤導(dǎo)致深度植入和過度灌注，同時(shí)促進(jìn)局部PECAM-1表達(dá)[9-10]。PECAM-1是通過其與浸潤的白細(xì)胞上存在的整聯(lián)蛋白(晚期抗原-4)的相互作用參與炎性細(xì)胞的遷移和募集的黏附分子。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧合酶-2(COX-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和誘導(dǎo)型NO合成酶(iNOS)在侵入性胎盤組織中的表達(dá)水平發(fā)生了改變，與對照胎盤組相比，侵入性胎盤中COX-2和iNOS水平明顯增加，其可能通過減少胎兒血流和增加胎兒血液循環(huán)中流動阻力加重疾病的嚴(yán)重程度[11-12]。本研究結(jié)果顯示，侵入性胎盤患者血清及胎盤組織中PECAM-1 mRNA、蛋白表達(dá)水平升高，這與上述研究符合，同時(shí)也提示，PECAM-1水平升高導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞過度增殖，這與侵入性胎盤發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。最新研究發(fā)現(xiàn)，血小板和中性粒細(xì)胞也通過促進(jìn)母體胎盤血管損傷參與侵入性胎盤的病理生理學(xué)改變。并且這些細(xì)胞的募集可能是由細(xì)胞黏附分子介導(dǎo)的[13-14]。免疫細(xì)胞進(jìn)入絨毛被認(rèn)為是由PECAM-1介導(dǎo)的，黏附分子在妊娠的正常發(fā)育中發(fā)揮作用，并且侵入性胎盤中黏附分子的分析將為澄清侵入性胎盤的病理生理學(xué)提供有用的信息。

VCAM-1是一種有效的血管生成生長因子，可促進(jìn)血管生成、一氧化氮和血管擴(kuò)張性細(xì)胞因子的分泌。在正常妊娠中，VCAM-1促使內(nèi)皮健康和血管舒張、支持胎盤發(fā)育所必需的血管生成。VCAM-1不可逆地與循環(huán)VEGF結(jié)合，阻止其與內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合并表達(dá)其生理作用。VEGF支持內(nèi)皮健康和血壓調(diào)節(jié)，能促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖生長。VCAM-1是通過其與浸潤的白細(xì)胞上存在的整聯(lián)蛋白(晚期抗原-4)的相互作用參與炎性細(xì)胞的遷移和募集的黏附分子[15]。用阻斷VCAM-1的貝伐單抗作用于滋養(yǎng)細(xì)胞可有效地抑制其生長。VCAM-1在嚙齒動物中的低表達(dá)產(chǎn)生了先兆子癇模型，其特征在于高血壓、蛋白尿和內(nèi)皮細(xì)胞增生的特征性腎小球變化[16-17]。受影響的動物可通過VEGF抑制劑治療獲救。研究報(bào)道，在先兆子癇妊娠中，VCAM-1在胎盤中呈明顯低表達(dá)[18-20]。雖然人類和動物研究支持VCAM-1在先兆子癇中的致病作用，但VCAM-1降低在侵入性胎盤中的作用尚不清楚。本次研究結(jié)果顯示，侵入性胎盤患者血清及胎盤組織中VCAM-1 mRNA、蛋白表達(dá)水平升高，導(dǎo)致螺旋動脈血管損傷以及胎盤炎性反應(yīng)，其與侵入性胎盤發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

綜上所述，侵入性胎盤患者血清及胎盤組織中PECAM-1 mRNA、蛋白表達(dá)水平，VCAM-1 mRNA、蛋白表達(dá)水平升高，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞過度增殖，螺旋動脈血管損傷以及胎盤炎性反應(yīng)，這與侵入性胎盤發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

宋學(xué)薇：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，論文撰寫；劉亞梅：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；孫佳：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；胡鑫、紀(jì)江海：參與研究過程，數(shù)據(jù)收集，分析整理