任娟，余青龍，卞西杰，張幫柱，曾安貴

胃癌是我國(guó)常見的消化道惡性腫瘤，手術(shù)治療、放化療等用于胃癌的治療使患者的預(yù)后得到了一定改善，但受到局部腫瘤復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移等因素的影響，胃癌患者的整體生存情況并不樂觀[1-2]。目前，胃癌的發(fā)病機(jī)制仍未闡明，進(jìn)而也限制了靶向治療藥物的研發(fā)。微小RNA(miRs)是一種在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的小分子RNA，通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)來介導(dǎo)相應(yīng)的生物學(xué)作用。miR-216a是具有抑癌特性的miR，在多項(xiàng)細(xì)胞研究中被證實(shí)能夠抑制肺癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖[3-5]。有研究報(bào)道胃癌病灶內(nèi)miR-216a的表達(dá)明顯下調(diào)[6]，提示miR-216a可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起到抑癌作用。本研究首先分析了胃癌患者血漿miR-216表達(dá)的變化，進(jìn)一步以胃癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象分析了miR-216a對(duì)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控作用，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年3月—2018年12月攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院普外科診治的胃癌患者和同期于醫(yī)院體檢健康志愿者。胃癌患者均經(jīng)病理學(xué)診斷且確診時(shí)均接受過放化療、生物治療、免疫治療等抗腫瘤治療，既往無其他惡性腫瘤病史。胃癌患者38例(胃癌組)：男22例，女16例，年齡39～61(45.67±8.23)歲；健康志愿者(健康組)50例：男 31例，女19例，年齡35～58(44.85±8.51)歲。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，全部受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 血漿miR-216a測(cè)定 采集空腹肘靜脈血3 ml，以天根公司的miRcute miRNA提取分離試劑盒和miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒分離血漿miR并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒對(duì)cDNA中的miR-216a進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增曲線計(jì)算miR-216a的表達(dá)水平[7]。

1.3 胃癌細(xì)胞增殖活力、信號(hào)通路測(cè)定

1.3.1 材料： 胃癌細(xì)胞株SGC-7901購(gòu)自 Sigma公司，細(xì)胞培養(yǎng)所用DMEM、胎牛血清(FBS)、0.125%胰蛋白酶購(gòu)自Hyclone公司，細(xì)胞增殖MTS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司，蛋白裂解液購(gòu)自Roche公司，miR-216a表達(dá)檢測(cè)所用試劑盒購(gòu)自北京天根公司，基因mRNA表達(dá)檢測(cè)所用試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司，PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK1/2的單克隆抗體及相應(yīng)的第二抗體購(gòu)自SantaCruz公司。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組： 胃癌細(xì)胞株SGC-7901用含有10%FBS的DMEM處理，細(xì)胞融合至80%后用0.125%胰蛋白酶進(jìn)行消化和傳代，傳代后的細(xì)胞分為miR-216a組(轉(zhuǎn)染miR-216a的模擬物)和陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染NC的模擬物)。

1.3.3 細(xì)胞增殖活力檢測(cè)：轉(zhuǎn)染模擬物后6、12、18、24 h，向培養(yǎng)基中加入MTS試劑盒中的檢測(cè)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，而后將培養(yǎng)板放置在酶標(biāo)儀上，讀取450 nm波長(zhǎng)處的吸光值，以此作為增殖活力值。

1.3.4 增殖基因mRNA表達(dá)檢測(cè)：轉(zhuǎn)染模擬物后24 h，采用康為世紀(jì)公司的超純RNA提取試劑盒和SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒分離細(xì)胞中的RNA并合成cDNA，采用UltraSYBR Mixture試劑盒對(duì)cDNA中的CyclinD1、Ki-67、Bcl-2、Gli-1、c-myc基因進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增曲線計(jì)算基因的mRNA表達(dá)水平。

1.3.5 信號(hào)通路分子蛋白表達(dá)檢測(cè)：轉(zhuǎn)染模擬物后24 h，采用蛋白裂解液分離提取細(xì)胞中的總蛋白，高溫變性后將蛋白樣本加入聚丙烯酰胺分離凝膠中，電泳分離蛋白后進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜，將分離凝膠中的蛋白樣本電轉(zhuǎn)移至NC膜后用5%脫脂牛奶對(duì)NC膜進(jìn)行封閉，2 h后用PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK1/2的第一抗體對(duì)NC膜進(jìn)行孵育，4℃過夜后取出，孵育第2抗體2 h。最后用ECL顯影系統(tǒng)顯示得到PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK1/2的蛋白條帶，根據(jù)條帶灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 2組血漿miR-216a表達(dá)比較 胃癌組血漿miR-216a表達(dá)為(0.64±0.10)，健康組為(1.02±0.18)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.703,P=0.000)。

2.2 2組胃癌細(xì)胞增殖活力值比較 轉(zhuǎn)染模擬物后6、12、18、24 h，miR-216a組的細(xì)胞增殖活力值明顯低于陰性對(duì)照組 (P<0.05)，見表1。

2.3 2組轉(zhuǎn)染模擬物對(duì)胃癌細(xì)胞中增殖基因表達(dá)比較 轉(zhuǎn)染模擬物后24 h，miR-216a組胃癌細(xì)胞中CyclinD1、Ki-67、Bcl-2、Gli-1、c-myc的mRNA表達(dá)水平均明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.01)，見表2。

2.4 2組轉(zhuǎn)染模擬物對(duì)胃癌細(xì)胞中增殖信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較 轉(zhuǎn)染模擬物后24 h，miR-216a組胃癌細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK1/2的蛋白表達(dá)水平均明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.05)，見表3。

3 討 論

胃癌發(fā)病機(jī)制及靶向治療手段一直是消化道腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。miR-216a是具有抑癌特性的miR，在多種惡性腫瘤細(xì)胞中均被證實(shí)能夠起到抑制細(xì)胞增殖、侵襲的作用，但關(guān)于miR-216a在胃癌中表達(dá)的變化及價(jià)值并未明確。為了明確miR-216a在胃癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用，本研究首先對(duì)胃癌患者血漿中miR-216a表達(dá)的變化進(jìn)行了分析，胃癌患者血漿中miR-216a的表達(dá)水平明顯低于健康志愿者，提示miR-216a的低表達(dá)與胃癌的發(fā)生有關(guān)，增加miR-216a可能是治療胃癌的潛在靶點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步以離體培養(yǎng)的SGC-7901胃癌細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過轉(zhuǎn)染miR-216a的模擬物來增加細(xì)胞內(nèi)miR-216a的表達(dá)，進(jìn)而探究miR-216a對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)及增加miR-216a對(duì)胃癌的潛在治療價(jià)值。轉(zhuǎn)染模擬物6、12、18、24 h后，miR-216a模擬物均能使胃癌細(xì)胞的增殖活力明顯下降，提示miR-216a在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中具有抑癌作用，增加miR-216a可能起到治療胃癌的作用。

miRs發(fā)揮生物學(xué)作用的方式是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，通過基因表達(dá)的改變產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。miR-216a作為具有抑癌特性的miR，能夠靶向抑制多種增殖基因的表達(dá)使增殖基因介導(dǎo)的促增殖作用減弱，進(jìn)而發(fā)揮其抑癌作用。在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中，CyclinD1、Ki-67、Bcl-2、Gli-1、c-myc是已知的重要增殖基因。CyclinD1編碼的產(chǎn)物直接參與細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控，能夠加速細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂[8]；Ki-67的編碼產(chǎn)物是一類核增殖抗原，在細(xì)胞核內(nèi)參與DNA的復(fù)制并與細(xì)胞的增殖活力直接相關(guān)[9]；Bcl-2的編碼產(chǎn)物對(duì)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放具有阻礙作用，通過阻礙細(xì)胞色素C釋放來增強(qiáng)細(xì)胞的增殖活力[10-11]；Gli1和c-myc是2種原癌基因，能夠通過多途徑誘導(dǎo)細(xì)胞惡變、促進(jìn)細(xì)胞增殖[12-13]。本研究在轉(zhuǎn)染模擬物后24 h檢測(cè)了細(xì)胞中上述增殖基因表達(dá)的變化，miR-216a組胃癌細(xì)胞中CyclinD1、Ki-67、Bcl-2、Gli-1、c-myc的mRNA表達(dá)水平均明顯低于陰性對(duì)照組，表明miR-216a對(duì)胃癌細(xì)胞中多種增殖基因的表達(dá)具有抑制作用，進(jìn)而提示靶向抑制增殖基因表達(dá)可能是miR-216a降低胃癌細(xì)胞增殖活力的分子途徑。

在癌細(xì)胞增殖過程中，增殖基因高表達(dá)后表達(dá)產(chǎn)物引起細(xì)胞增殖活力的改變涉及復(fù)雜的生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路和MEK/ERK1/2信號(hào)通路是與多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)的通路。在PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活過程中，PI3K和AKT依次發(fā)生磷酸化并活化，進(jìn)而引起mTOR發(fā)生磷酸化并啟動(dòng)下游多種增殖基因的表達(dá)[14-15]。在MEK/ERK1/2信號(hào)通路的激活過程中，MEK首先發(fā)生磷酸化活化，引起下游MAPK家族中的多個(gè)成員發(fā)生磷酸化后進(jìn)一步造成ERK1/2磷酸化活化，活化的ERK1/2能夠進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)多種增殖基因的表達(dá)[16-17]。本研究在轉(zhuǎn)染模擬物后24 h檢測(cè)了細(xì)胞中上述信號(hào)通路分子磷酸化的程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-216a組胃癌細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK1/2的蛋白表達(dá)水平均明顯低于陰性對(duì)照組，提示miR-216a對(duì)胃癌細(xì)胞中介導(dǎo)增殖的PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路和MEK/ERK1/2信號(hào)通路具有抑制作用，通過抑制信號(hào)通路的活化來起到抗癌作用。

表1 陰性對(duì)照組和miR-216a組細(xì)胞增殖活力值比較

表2 陰性對(duì)照組和miR-216a組細(xì)胞中增殖基因表達(dá)的比較

表3 陰性對(duì)照組和miR-216a組細(xì)胞中增殖信號(hào)通路蛋白表達(dá)的比較

綜上所述，胃癌患者血漿miR-216a的表達(dá)缺失，且增加miR-216a表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖，具體表現(xiàn)為miR-216a能夠靶向抑制多種增殖基因的表達(dá)及增殖信號(hào)通路的活化。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

任娟:進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作及論文撰寫；余青龍、張幫柱：臨床樣本收集；卞西杰：數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；曾安貴：論文審核與修改