聶梅，張紅，馮雁夢，牛顏冰，呂晉慧

(1.山西農(nóng)業(yè)大學林學院，山西 太谷 030800；2.山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西 太谷 030800)

太行菊屬作為菊科菊蒿亞族植物[1]，僅包括太行菊(Opisthopappustaihangensis)和長裂太行菊(Opisthopappuslongilobus)兩個種，均可分泌芳香物質(zhì)，尤以長裂太行菊為佳，將其與菊屬品種雜交有可能獲得具有芳香味的菊花新品種，對于瀕危種質(zhì)資源的保存和應用意義重大.菊花是高度雜合的異源多倍體，且為異花授粉植物，菊科不同屬間天然雜交現(xiàn)象時常發(fā)生，使得菊花自交親和性差、結(jié)實率低[2-3].授粉后，花粉萌發(fā)及花粉管生長是否正常是衡量雜交親本是否存在受精前障礙的重要標志之一[4].近年來，研究者們使用多種授粉方法克服屬間及種間雜交障礙，如李辛雷等[5]采用的混合花粉授粉法，陳瓊等[6]使用的切割柱頭授粉法，王旭等[7]用硼酸處理柱頭等法均可提高芍藥的親和指數(shù)；耿興敏[8]用鹽水涂抹柱頭增加了杜鵑雜交結(jié)實率.關于克服菊花受精前障礙方面，目前常用的方法有混合授粉、重復授粉、切割柱頭以及花粉培養(yǎng)液等[9-10]，其中液體介質(zhì)授粉法在不同品種菊花自交中應用較為廣泛，但在菊科近緣屬雜交中尚未見報道.因此，通過不同化學藥劑處理柱頭或花粉，是否增強異種柱頭接受異緣花粉的能力，是克服菊科不同屬間受精前障礙研究中亟待解決的問題.本研究將太行菊屬長裂太行菊與地被菊‘賽牡丹’雜交，采用不同授粉方法處理花粉及柱頭，探究其對太行菊屬及其近緣屬雜交后花粉附著、萌發(fā)及花粉管生長的影響，旨在為菊科不同屬間品種遠緣雜交提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試材為2個菊科近緣屬品種，長裂太行菊(2n=18)為野生種，‘賽牡丹’(2n=54)為自育品種.

1.2 試驗方法

1.2.1 雜交方法 于9月中旬晴天10∶00～14∶00進行人工授粉，授粉前母本去雄，同時剪至可見Y型柱頭(不能傷及柱頭)，授粉后進行套袋隔離并做好標記.

1.2.2 授粉方法 以長裂太行菊(♀)ב賽牡丹’(♂)為親本，以新鮮花粉直接授粉作對照.

液體介質(zhì)授粉法：配制等體積的液體介質(zhì)于4 ℃冰箱中保存，使用前混入新鮮花粉100 mg.授粉后0.5、1、2、4、8、12、24 h觀察記錄.液體介質(zhì)為：

① 100 mg/L蔗糖；② 100 mg/L蔗糖+Ca2+(0.1、0.3、0.6 mg/L)；③ 100 mg/L蔗糖+硼酸(0.025、0.05、0.1 mg/L).

NaCl涂抹柱頭法：2%、5%、8% NaCl分別處理柱頭0.5、1、6、12 h，授粉后0.5、2、6、12、24 h觀察記錄.

1.2.3 熒光顯微觀察 授粉后于不同觀察時間分別取5個花序，用FAA固定液(70%酒精∶冰醋酸∶福爾馬林=90∶5∶5)固定，4 ℃下保存?zhèn)溆?觀察時用1 mol/L氫氧化鈉軟化脫色7 h，蒸餾水沖洗3～4次，用含0.1 mol/L磷酸三鉀的0.1%苯胺藍溶液浸泡4 h，用甘油做雌蕊壓片.在Olympus-BX61熒光顯微鏡下觀察并拍照.統(tǒng)計花粉附著和萌發(fā)情況，并計算以下指標：

平均每柱頭附著花粉數(shù)=附著花粉數(shù)/觀察雌蕊數(shù)

平均每柱頭萌發(fā)花粉數(shù)=萌發(fā)花粉數(shù)/觀察雌蕊數(shù)

1.3 數(shù)據(jù)處理

應用Excel2010和SPSS19.0軟件進行整理分析，采用Duncan新復極差法進行差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同液體介質(zhì)對花粉附著和萌發(fā)的影響

2.1.1 以蔗糖為介質(zhì)對花粉附著和萌發(fā)的影響 以蔗糖為介質(zhì)授粉，柱頭上花粉的附著數(shù)及萌發(fā)數(shù)均隨著授粉后時間的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(圖1).其中，授粉后1 h，100 mg/L蔗糖處理下花粉附著數(shù)為9.8粒，為新鮮花粉的4.08倍.授粉后1～4h，100 mg/L蔗糖處理下花粉附著數(shù)變化不大，授粉后8 h，100 mg/L蔗糖處理下花粉附著數(shù)高達15.5粒，顯著高于新鮮花粉(P<0.05).超過8 h后，100 mg/L蔗糖處理下花粉附著數(shù)仍多于對照.

授粉后1～4 h，100 mg/L蔗糖處理下花粉萌發(fā)數(shù)均顯著高于新鮮花粉(P<0.05)，授粉后8 h，花粉萌發(fā)量最多，為3.5粒，授粉后12、24 h，蔗糖及對照處理下花粉萌發(fā)量均為0.以蔗糖為介質(zhì)授粉，花粉萌發(fā)均正常，花粉管生長粗且直(圖4).

2.1.2 以Ca2+為介質(zhì)對花粉附著與萌發(fā)的影響

不同濃度Ca2+授粉后花粉的附著數(shù)和萌發(fā)數(shù)均隨著授粉后時間的增加呈現(xiàn)先升后降趨勢(圖2).其中，授粉后2 h，0.1 mg/L Ca2+處理花粉的附著數(shù)和萌發(fā)數(shù)分別為8.1粒、3.6粒，顯著高于其他處理(P<0.05)，比對照提前6 h達到最大值，授粉超過4 h后，對照處理花粉的附著數(shù)及萌發(fā)數(shù)均顯著高于其他處理(P<0.05).授粉后1 h，0.3 mg/L Ca2+處理附著的花粉數(shù)為5粒，顯著高于對照和0.1 mg/L Ca2+處理，花粉的萌發(fā)數(shù)卻顯著低于后者(P<0.05)，且不同時間觀察柱頭上花粉的萌發(fā)數(shù)變化不大.不同時間觀察0.6 mg/L Ca2+處理后花粉的附著數(shù)及萌發(fā)數(shù)均低于對照及其他處理.以不同濃度Ca2+為介質(zhì)授粉，柱頭上花粉量有所差異，花粉管正常生長(圖4).

同一時間點不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05).Different letters at the same time point represent significant differences between treatments(P<0.05).圖1 以蔗糖為介質(zhì)對花粉附著和萌發(fā)的影響Figure 1 Effect of sucrose on pollen attachment and germination

同一時間點不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05).Different letters at the same time point represent significant differences between treatments(P<0.05).圖2 以Ca2+為介質(zhì)授粉對花粉附著與萌發(fā)的影響Figure 2 Effect of pollination with Ca2+ on pollen attachment and germination

2.1.3 以硼酸為介質(zhì)對花粉的附著與萌發(fā)的影響 不同濃度硼酸授粉后花粉的附著數(shù)和萌發(fā)數(shù)均隨著授粉后時間的增加呈現(xiàn)先升后降趨勢(圖3).其中，授粉后1～8 h內(nèi)，對照處理柱頭上附著量顯著高于不同濃度硼酸處理(P<0.05)(圖3-A).授粉后4 h，0.025、0.05 mg/L硼酸及對照處理附著數(shù)均達到最大值，分別為7.4粒、6.5粒、13.4粒，授粉后2 h，0.1 mg/L硼酸處理附著數(shù)為4.8粒，比其他處理提前2 h達到最值.

授粉后1 h，0.025 mg/L硼酸處理花粉的萌發(fā)數(shù)顯著高于其他處理(P<0.05)(圖3-B).授粉后2～8 h，不同濃度硼酸處理花粉的萌發(fā)數(shù)均顯著低于對照(P<0.05)，授粉后12、24 h，各處理花粉的萌發(fā)量接近0.以不同濃度硼酸為介質(zhì)授粉，花粉管萌發(fā)正常(圖4).

2.2 不同濃度NaCl處理柱頭對花粉附著與萌發(fā)的影響

由圖5可知，不同處理花粉的附著數(shù)均隨著NaCl濃度的升高而增加.同一濃度下，花粉附著數(shù)隨著NaCl處理柱頭時間的增加而降低，最佳處理時間為0.5 h.其中，不同濃度NaCl處理柱頭0.5 h、1 h，不同時間觀察，8%NaCl處理附著的花粉數(shù)顯著高于其他處理(P<0.05).授粉后24 h，8% NaCl處理柱頭0.5 h花粉的附著數(shù)高達32粒，分別為對照(新鮮花粉)、2% NaCl和5% NaCl處理的6.97倍、1.84倍、2.09倍.不同濃度NaCl處理柱頭6 h，黏附的花粉數(shù)存在差異.授粉后6、12 h，2%、5% NaCl處理花粉的附著數(shù)顯著高于8%NaCl處理(P<0.05)，授粉后0.5～12 h，8% NaCl處理附著數(shù)變化不大，授粉后24 h附著數(shù)達到最大值.

同一時間點不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05).Different letters at the same time point represent significant differences between treatments(P<0.05).圖3 以硼酸為介質(zhì)授粉對花粉附著與萌發(fā)的影響Figure 3 Effect of pollination with boric acid on pollen adhesion and germination

A1～A4：100 mg/L 蔗糖授粉后0.5、1、2、8 h；B1～B2：0.1 mg/L、0.3 mg/L Ca2++100 mg/L蔗糖授粉后1 h；B3～B4：0.025 mg/L、0.05 mg/L硼酸+100 mg/L蔗糖授粉后1 h.A1～A4：0.5,1,2 and 8 h after pollination with 100 mg/L sucrose；B1～B2：0.1 mg/L,0.3 mg/L Ca2++100 mg/L sucrose for 1 h after pollination；B3～B4：0.025 mg/L,0.05 mg/L Boric acid +100 mg/L sucrose for 1 h after pollination.圖4 不同液體介質(zhì)對花粉附著及萌發(fā)的影響Figure 4 Effects of different liquid mediums on pollen adhesion and germination

A～D：不同濃度NaCl處理0.5、1、6、12 h后花粉的附著數(shù)；E～G：不同濃度NaCl處理0.5、1、6 h后花粉的萌發(fā)數(shù).A～D: The adhesion number of pollen after treatment of 0.5,1,6 and 12 h with different concentrations NaCl；E～G: The germination number of pollen after treatment of 0.5,1 and 6 h with different concentrations NaCl.圖5 不同濃度NaCl處理柱頭對花粉附著與萌發(fā)旳影響Figure 5 Effects of different concentrations of NaCl treatment on pollen attachment and germination

隨著授粉后時間的增加，不同濃度NaCl處理柱頭相同時間，花粉萌發(fā)數(shù)變化趨勢存在差異.其中，8%NaCl處理6 h，授粉后0.5 h，花粉的萌發(fā)數(shù)顯著高于2%、5% NaCl處理及對照(P<0.05),不同濃度處理柱頭12 h，花粉萌發(fā)數(shù)均為0.此外，不同濃度NaCl處理對花粉管的影響不同.其中，2%NaCl處理柱頭0.5、1 h，花粉管頂端出現(xiàn)破裂、分叉現(xiàn)象，5%NaCl處理柱頭0.5 h后，花粉管出現(xiàn)扭曲現(xiàn)象，8%NaCl處理柱頭0.5 h后，花粉萌發(fā)正常，花粉管頂端未出現(xiàn)異常(圖6).

A～C：2%、5%、8% NaCl分別處理柱頭0.5、1、6 h后授粉.A～C:2%,5%,8% NaCl respectively deal with the stigma for 0.5,1,6 h before pollination.圖6 不同濃度NaCl處理0.5、1、6 h后花粉的附著和萌發(fā)Figure 6 Pollen attachment and germination after different concentrations of NaCl treatment for 0.5、1、6 h

3 討論

菊花是孢子體型自交不親和植物，其雌蕊柱頭為干性的，通?；ǚ哿１灰种撇课怀霈F(xiàn)在柱頭上.授粉后花粉的黏附與萌發(fā)數(shù)量少、胼胝質(zhì)過多沉淀、花粉管異常生長，均可導致雜交親本產(chǎn)生受精前障礙，增加受精失敗的概率.

3.1 液體介質(zhì)授粉法對花粉附著和萌發(fā)的影響

適宜的糖分可改善干燥型柱頭的濕潤度和花粉的活力，花粉易萌發(fā)[9].糖類物質(zhì)除了為花粉萌發(fā)提供營養(yǎng)外，同時還具維持外界環(huán)境的滲透壓，以促進花粉管生長[11].鄧盛斌[12]、徐芬芬等[13]認為，適宜的蔗糖利于花粉萌發(fā)和花粉管生長.羅鳳霞等[14]發(fā)現(xiàn)，花粉培養(yǎng)液添加100 mg/L蔗糖對百合雜交結(jié)籽普遍有促進作用.以上研究與本試驗結(jié)果基本一致，授粉后1～8 h，100 mg/L蔗糖可明顯促進花粉附著和花粉萌發(fā)，且花粉管生長正常.孫春青等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)，人工授粉后24 h，平均每柱頭上萌發(fā)的花粉數(shù)量最多，這與本試驗結(jié)果存在差異，授粉后8 h，長裂太行菊柱頭上花粉附著量最大，超過8 h后，其花粉附著量仍多于對照，但花粉萌發(fā)數(shù)降為0，說明100 mg/L蔗糖可促進花粉附著，且促進作用持續(xù)較久.

Ca2+是花粉萌發(fā)和花粉管生長的關鍵物質(zhì)，且外源鈣可作為萌發(fā)時群體效應的替代因子[16].本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度Ca2+明顯促進花粉附著和萌發(fā)，高濃度Ca2+則表現(xiàn)出抑制作用.這與賈文慶等[17]、鄭昀曄等[18]研究結(jié)論一致，外源鈣可顯著提高地被菊柱頭上異緣花粉的萌發(fā)率.薛曉敏等[19]、儲立民等[20]、姚成義等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+主要影響花粉萌發(fā)、花粉管生長速度.本研究中不同濃度Ca2+處理后花粉管粗且直，但對于花粉管生長速度的影響有待深入研究.孫鵬等[22]發(fā)現(xiàn)授粉后2 h，授粉作用促使柱頭胞外基質(zhì)的鈣含量增加，這與本實驗結(jié)果一致，0.1 mg/L Ca2+授粉后2 h，明顯促進花粉附著和萌發(fā)，隨著授粉后時間的增加，促進作用減弱.在試驗中還發(fā)現(xiàn)，0.3 mg/L Ca2+授粉后1 h促進花粉附著，但不利于花粉萌發(fā)，這可能是由地被菊柱頭上存在的某種抑制物所致.

硼元素可增加氧的吸收，還可促進糖平衡，與糖結(jié)合能極大地提高花粉的萌發(fā)率，且利于花粉管的形成、萌發(fā)[23].迄今有關硼酸對花粉萌發(fā)的研究多數(shù)認為一定濃度的硼酸有利于花粉萌發(fā)和花粉管生長.蔣桂華等[24]發(fā)現(xiàn)，0.3 g/L硼酸促進草莓花粉萌發(fā)和花粉管生長.杜玉虎等[25]發(fā)現(xiàn)，0.02%硼酸可顯著促進花粉萌發(fā)和花粉管生長.韓志強等[26]認為0.015 g/L硼酸處理后，棗花粉的萌發(fā)率最高.這與本試驗結(jié)果并不一致，且硼酸濃度高于試驗中的處理水平，0.025 mg/L硼酸授粉后1 h花粉萌發(fā)量顯著多于對照，不同濃度硼酸授粉后0.5～24 h花粉附著量均低于對照，這可能與不同親本花粉的內(nèi)源硼含量有關.

硼離子是酯化果膠的主要成分，參與花粉管壁脫酯化過程，可增加花粉管壁的可塑性[27].外源硼利于花粉管形成及生長，這與試驗中熒光顯微觀察的結(jié)果一致，不同濃度硼酸處理后花粉管正常生長，粗且直.

3.2 NaCl涂抹柱頭法對花粉附著和萌發(fā)的影響

NaCl可破壞柱頭表面的蛋白層，對異源花粉的排斥力下降，說明鹽處理在一定程度上能克服受精障礙[28].本研究得出，不同濃度NaCl處理柱頭，授粉后24 h內(nèi)，對花粉附著及萌發(fā)均表現(xiàn)出不同程度的促進作用，但花粉管生長情況存在差異.安彩泰等[29]發(fā)現(xiàn)，10%NaCl溶液處理柱頭后顯著提高甘藍型油菜的萌發(fā)率.羅鳳霞等[14]認為，食鹽水對花粉萌發(fā)的促進作用不穩(wěn)定.耿興敏等[8]、李建廠等[30]認為，0.3%與1.0%鹽介質(zhì)均對花粉萌發(fā)表現(xiàn)出顯著的負效應.試驗中發(fā)現(xiàn)，不同濃度NaCl處理柱頭0.5 h，授粉后24 h，柱頭上花粉附著量最高，但花粉的萌發(fā)量顯著少于對照.由此可推斷，花粉與雌蕊柱頭相互識別作用的過程中，雌蕊柱頭上可能存在抑制因子,阻礙了花粉的正常萌發(fā)，因而僅有較少花粉能夠在柱頭萌發(fā).NaCl通過破壞柱頭表面的乳突細胞，減少了胼胝質(zhì)反應，達到了克服雜交障礙的作用[31].本研究中，隨著處理時間的增加，不同濃度NaCl涂抹柱頭均可抑制萌發(fā)，這是由于NaCl處理過久，致使乳突細胞出現(xiàn)萎蔫，影響柱頭活性.試驗中較低濃度(2%、5%)NaCl處理后花粉管出現(xiàn)扭曲、分叉現(xiàn)象，這與NaCl溶液克服自交不親和的作用機理相悖[32]，可能是不同物種特性對NaCl的濃度要求不一.

4 結(jié)論

采用不同液體介質(zhì)授粉，花粉附著數(shù)及萌發(fā)數(shù)授粉后24 h內(nèi)呈現(xiàn)先增后減的趨勢，100 mg/L蔗糖可顯著促進花粉的附著和萌發(fā).低濃度Ca2+(0.1 mg/L)促進花粉的附著及萌發(fā)，高濃度Ca2+(0.6 mg/L)則表現(xiàn)出抑制作用.0.025 mg/L硼酸對花粉萌發(fā)表現(xiàn)出一定的促進作用.授粉后24 h內(nèi)，不同濃度NaCl處理柱頭后，花粉附著及萌發(fā)及花粉管生長情況存在差異.高濃度(8%)NaCl處理柱頭可顯著促進花粉附著及萌發(fā)，且花粉管生長粗且直，低濃度(2%、5%)NaCl處理下花粉管出現(xiàn)分叉、扭曲等異?，F(xiàn)象.

綜上可知，采用不同授粉方法有利于克服太行菊屬與菊屬雜交受精前障礙，從一定程度上提高菊科近緣屬雜交親和性.一般認為,花粉內(nèi)外源鈣促進萌發(fā)的效果不如硼離子顯著，但試驗中硼酸對花粉附著及萌發(fā)的作用不如鈣離子明顯，是否受父母本正反交的影響，還有待深入研究.