馬懷義，賀學(xué)鋒，張曉燕,馬雄,丁耀錄,馬玲

(1.甘肅民族師范學(xué)院,甘肅 合作 747000；2.甘肅省甘南藏族自治州食品檢驗檢測中心,甘肅 合作 747000; 3.甘肅省甘南藏族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,甘肅 合作 747000)

小葉黑柴胡(BupleurumsmithiiWolff var.parvifolium)為傘形科柴胡屬多年生草本植物，常作為柴胡藥用，喜溫光，耐寒性較強，主要分布于甘肅、青海、寧夏等地區(qū)海拔2 700～3 700 m的山坡草地及林下[1-2].化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，小葉黑柴胡植株中含有柴胡皂甙、黃酮類、酚類、甾醇、多糖、揮發(fā)油等化合物[3-5].藥理學(xué)研究表明，小葉黑柴胡根具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、保肝、增強免疫功效[6-7]；莖葉中黃酮類化合物對動物膽汁淤積性、化學(xué)性、免疫性肝損傷具有保護(hù)作用[8]；柴胡皂苷具有抗癲癇、抑制肝臟癌細(xì)胞增殖的功能[9].

近年來，對小葉黑柴胡的研究主要集中在栽培生理特性[10]、皂苷含量測定[11-12]、藥理作用[13]等方面，而在產(chǎn)量與品質(zhì)形成機制方面的研究鮮見報道.甘南地區(qū)位于青藏高原東北緣，屬高寒陰濕區(qū)，大部分地區(qū)海拔3 000 m以上，較適宜于小葉黑柴胡的生長.為了探明該植物在甘南地區(qū)的生長適應(yīng)性及其活性物質(zhì)的積累，本研究以野生小葉黑柴胡根、莖和葉為試驗材料、對其生物量、總黃酮、酚、皂苷類及抗氧化能力進(jìn)行測定與分析，旨在為種植區(qū)域選擇、大面積栽培推廣及其品質(zhì)評價提供一定的理論基礎(chǔ)與技術(shù)參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生小葉黑柴胡于2018年10月中旬采自甘肅省合作市當(dāng)周草原(N 34°57′17″，E 102°53′13″，海拔3 000 m)，根、莖和葉經(jīng)流水沖洗后，陰干備用.

1.2 試驗方法

1.2.1 提取液的制備 取陰干的根、莖和葉，粉碎后過80目篩；準(zhǔn)確稱取2.0 g粉末置于70%乙醇(30 mL)離心管中，37 ℃、150 r/min遮光振蕩提取72 h，然后5 000 r/min離心15min；連續(xù)提取3次，收集上清液，用70%乙醇定容至100 mL，用于總黃酮、酚、皂苷類及抗氧化能力的測定.

1.2.2 總黃酮、酚、皂苷類化合物含量的測定總黃酮類化合物含量的測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法[14-15]，總酚類化合物含量的測定采用福林酚試劑法[16-17]，總皂苷類化合物含量的測定采用紫外分光光度法[18].

1.2.3 抗氧化能力的測定抗氧化能力采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和鐵離子還原/氧化能力(FRAP)[19-20]2種方法綜合評價.

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，單因素(one-way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 單株的根、莖、葉生物量

植物的形態(tài)建成和單株不同器官生物量的積累受基因和環(huán)境因子共同調(diào)控，生長于3 000 m以上地區(qū)的野生小葉黑柴胡不同器官生物量的積累如圖1所示，莖的干質(zhì)量(0.34 g/株)顯著高于根(0.14 g/株)和葉(0.15 g/株)(P<0.05)，分別為根、葉干質(zhì)量的2.43和2.67倍，而根和葉之間無顯著差異(P>0.05).

2.2 根、莖、葉總黃酮類化合物的含量

黃酮類化合物在不同植物物種、品種和植株個體間分布不同，在同一植株的不同組織器官中分布也不盡相同，如圖2所示，生長于高海拔地區(qū)的野生小葉黑柴胡根、莖和葉總黃酮類化合物含量存在較大差異；葉中含量(274.36 mg/g)分別為莖和根的2.23和8.60倍(圖2-A)；莖和葉中單株含量較高，達(dá)到42 mg/株以上，顯著高于根(P<0.05，圖2-B).

圖1 甘南野生小葉黑柴胡單株根、莖、葉的干質(zhì)量Figure 1 Comprison of root，stem and leaf dry weight on a per plant basis of wild B.smithii located in Gannan region

圖2 甘南野生小葉黑柴胡根、莖和葉中黃酮類含量(A)和單株不同器官含量(B)的比較Figure 2 Comprison of flavonoids contents in root，stem and leaf on a dry weight (A) and per plant basis (B) of wild B.smithii located in Gannan region

2.3 根、莖和葉總酚類化合物的含量

因不同植物物種和個體的基因型不同，生存環(huán)境的差異，導(dǎo)致植株體不同器官對外界逆境適應(yīng)和抵抗能力不同，次生代謝酚類化合物的合成與分布也不相同.生長于高海拔地區(qū)的野生小葉黑柴胡根、莖和葉總含量如圖3所示存在較大差異；葉中含量(387.77 mg/g)分別為莖和根的1.84和8.87倍(圖3-A)；莖中單株含量最高(71.70 mg/株)，分別為葉和根的1.25和11.87倍(圖3-B).

2.4 根、莖和葉總皂苷類化合物的含量

皂苷類化合物是植物次生代謝的一類重要化合物，不同物種，同一物種的不同品種以及環(huán)境條件都會導(dǎo)致不同植株個體，同一植株個體不同的器官合成不同的皂苷類化合物，其含量也不盡相同.生長于高海拔地區(qū)的野生小葉黑柴胡根、莖和葉總皂苷類化合物含量如圖3所示，根、莖和葉存在較大差異；根中含量(13.75 mg/g)分別為莖和葉的2.95和1.61倍(圖4-A)；單株根中含量也最高(1.9 mg/株)，分別為莖和葉的1.19和1.50倍(圖4-B).

2.5 小葉黑柴胡根、莖和葉抗氧化能力

根據(jù)上述試驗結(jié)果，生長于高海拔地區(qū)的野生小葉黑柴胡根、莖和葉不同器官中次生代謝物黃酮類，酚類和皂苷類含量不盡相同，可能導(dǎo)致不同組織器官的抗氧化能力也不同，為了確證這一推斷，進(jìn)行了根、莖和葉浸提液的抗氧化能力分析，結(jié)果如圖5所示，根、莖、葉提取液自由基抑制率和FRAP值均表現(xiàn)為葉>莖>根，且達(dá)到顯著水平(P<0.05)，葉抑制率(92.43%)和FRAP值(7 137.89 μmol/L)分別為莖、根的1.06、5.94倍(圖5-A)和1.34、12.91倍(圖5-B).

3 討論

很多研究已經(jīng)表明，植物的生長發(fā)育及其代謝產(chǎn)物(初級和次級)是在長期進(jìn)化過程中與環(huán)境(生物的和非生物的)相互作用的結(jié)果，代謝產(chǎn)物在植物提高自身生態(tài)適應(yīng)性方面充當(dāng)著重要角色，其種類與積累易受到生長環(huán)境(如光、溫和水等)的調(diào)控[21-22].植物次級代謝不同于初級代謝，不僅存在種屬特異性，而且同一種或一類次級代謝產(chǎn)物在同一科屬植物體內(nèi)也存在差異性，且限制于特定的細(xì)胞、組織和器官[22-24].

圖3 甘南野生小葉黑柴胡根、莖和葉中總酚類 (A)和單株不同器官含量(B)的比較Figure 3 Comprison of phenolics contents in root，stem and leaf on a dry weight (A) and per plant basis (B) of wild B.smithii located in Gannan region

圖4 甘南野生小葉黑柴胡根、莖和葉中總皂苷類含量(A)和單株不同器官含量(B)的比較Figure 4 Comprison of saikosaponins contents in root，stem and leaf on a dry weight (A) and per plant basis (B) of wild B.smithii located in Gannan region

圖5 甘南野生小葉黑柴胡根、莖和葉提取液抑制率(A)和FRAP值(B)的比較Figure 5 Comprison of inhibition rate(A) and FRAP value (B) in root，stem and leaf of wild B.smithii located in Gannan region

周亞福等[18]通過對紫花大葉柴胡不同器官(根、莖、葉)結(jié)構(gòu)與活性成分柴胡皂苷和黃酮類化合物的積累關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)根、莖、葉中柴胡黃酮類化合物和總皂苷干質(zhì)量含量均呈現(xiàn)為葉>根>莖.湯芳玲等[25]通過對不同產(chǎn)地(青海省、內(nèi)蒙)小葉黑柴胡不同器官(根莖結(jié)合部、莖、葉)中黃酮化合物含量進(jìn)行比較與分析，發(fā)現(xiàn)隨地上部分升高黃酮化合物干重含量呈現(xiàn)增加的趨勢；該研究結(jié)果中根、莖和葉黃酮和酚類化合物干重含量均表現(xiàn)為葉>莖>根，與湯芳玲等[25]研究結(jié)果基本一致；而單株不同器官含量則呈現(xiàn)為莖>葉>根.這說明品種和環(huán)境因素對柴胡屬植物生長及其次級代謝產(chǎn)物在不同器官中的分布與積累具有顯著的影響.本研究中野生小葉黑柴胡生長于甘南藏自治州草原地帶(海拔3 000 m)，具有低溫、強光照和紫外線輻射等的特點，可能使得黃酮和酚類化合物以及總皂苷含量和單株不同器官含量在根、莖、葉中存在較大差異.

研究證明，黃酮類化合物具有吸收紫外線、減少輻射對植物的傷害，并促進(jìn)紫外吸收物生物合成的功能[26]；酚類化合物可使植株對低溫、輻射等逆境脅迫起到防御作用[27].馬金娥等[28]研究認(rèn)為，不同居群、同一居群夏蠟梅不同器官(根、莖、枝和葉)中黃酮類化合物種類和含量存在較大差異，其中位于頂層、光照強度大的居群下黃酮類化合物含量較高.李正華[29]研究認(rèn)為，氣溫降低可提高楊樹葉片中酚類化合物的含量.本研究小葉黑柴胡中黃酮和酚類類化合物含量由形態(tài)學(xué)上端至上形態(tài)學(xué)下端 (葉>莖>根)的降低可能與器官受到的強光照與低溫有一定的相關(guān)性.

本研究對甘南高原野生小葉黑柴胡不同器官(根、莖、葉)生物量、主要活性物質(zhì)(黃酮和酚類)以及抗氧化能力進(jìn)行了檢測分析，研究結(jié)果可為小葉黑柴胡高海拔區(qū)域種植栽培、各器官開發(fā)與利用提供一定的理論基礎(chǔ).而對于小葉黑柴胡高海拔區(qū)的產(chǎn)量形成與活性成分積累的生理生化和分子機制，還需要進(jìn)一步深入的研究.