袁中偉，谷可欣，張?zhí)煲?，申翰君，周能華，李超，尹立子

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130)

松蘿酸又名地衣酸，主要存在于松蘿屬、樹發(fā)屬、樹花屬、扁枝衣屬、島衣屬、石蕊屬、梅衣屬、茶漬屬和赤星衣屬等屬的地衣中，是一種呋喃類強(qiáng)力抗生素[10].目前廣泛應(yīng)用于止血，抗菌，消炎，傷口愈合，除牙斑，可以增強(qiáng)人體免疫力，對口腔潰瘍病和陰道炎有較好的療效[11].研究發(fā)現(xiàn)，松蘿酸對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、短鏈芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)均有一定的抑制作用[12-13].然而松蘿酸對MRSA抑菌機(jī)制尚不清楚.因此，本試驗選取MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株USA300為研究對象，通過研究松蘿酸對USA300細(xì)胞膜和細(xì)胞壁通透性、蛋白質(zhì)代謝、乳酸脫氫酶、形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物被膜的形成等方面的影響，闡述松蘿酸抑制MRSA的作用機(jī)制，研究結(jié)果將為松蘿酸及含松蘿酸成分的中藥用于抗MRSA感染提供可靠的理論依據(jù).

1 材與和方法

1.1 試驗材料

UV-2000型紫外分光光度計(UNICO，美國)；微量分光光度計NanoDrop One(Thermo，美國)；HT7700透射電鏡(Hitachi，日本)；ZD-85A氣浴恒溫振蕩器(金壇市科析儀器有限公司，中國).

1.2 試驗方法

1.2.1 敏感性試驗 采用液體倍比稀釋法測定松蘿酸對USA300的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)[14].采用瓊脂平板菌落記數(shù)法測定松蘿酸對USA300的最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)[15].

采用比濁法探究不同濃度松蘿酸對USA300生長的影響[16].挑取USA300菌落接種至試管中，37 ℃靜置培養(yǎng)10 h，菌液按2%接種到BHI液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).當(dāng)菌液OD600=0.3時，加入松蘿酸，使培養(yǎng)基中松蘿酸的終質(zhì)量濃度分別為0、8、16、32、64、128、256 μg/mL.加藥后的培養(yǎng)基置于氣浴恒溫振蕩器(37 ℃，200 r/min)培養(yǎng)，在0、1、2、4、6、8、16、24 h使用紫外分光光度計測定培養(yǎng)基的OD600，根據(jù)吸光度值繪制生長曲線.

1.2.2 細(xì)胞內(nèi)DNA泄漏的測定 109CFU/mL的USA300菌液用PBS緩沖液洗滌2次，用PBS緩沖液定容至107CFU/mL.將該菌懸浮液與松蘿酸(256 μg/mL)在37 ℃條件下靜置培養(yǎng).在松蘿酸作用0、1、2、4、6 h后，菌懸液5 500 r/min離心10 min，用微量分光光度計測定上清液中DNA含量[17].其他條件不變，以不加藥組作為對照組.

1.2.3 可溶性蛋白質(zhì)含量的測定 向109CFU/mL USA300菌液中加入松蘿酸，使培養(yǎng)液中松蘿酸終質(zhì)量濃度為256 μg/mL.氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)(37 ℃，200 r/min)2、6 h時分別取懸浮液并BHI培養(yǎng)基稀釋至108CFU/mL.菌懸液5 000 r/min離心10 min，用PBS緩沖液洗滌2次并定容，然后進(jìn)行超聲破碎.超聲破碎液一部分用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其蛋白質(zhì)含量.剩下的按3∶1體積比加入4×雙色蛋白上樣緩沖液，混勻，在沸水浴中煮沸10 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE[18].其他條件不變，以不加藥組作為對照組.

1.2.4 乳酸脫氫酶(LDH)的測定 將USA300菌液(109CFU/mL)與松蘿酸(256 μg/mL)共培養(yǎng)0、1、2、4、6、8 h后取菌懸液并稀釋至108CFU/mL.稀釋的菌懸液離心(5 000 r/min，10 min，4 ℃)，收集菌體沉淀用PBS定容混勻并超聲破碎.所得樣品離心(5 000 r/min，10 min，4 ℃)，用乳酸脫氫酶測定試劑盒測定其LDH濃度[19].其他條件不變，以不加藥組作為對照組.

如何減少學(xué)術(shù)期刊對作者利益的侵害，轉(zhuǎn)變作者對學(xué)術(shù)期刊的抵制為支持呢？近年來，國內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊出版機(jī)構(gòu)采取了許多措施以避免期刊與作者的利益沖突。 例如，總部設(shè)在英國的出版?zhèn)惱砦瘑T會(COPE)制定了詳細(xì)的學(xué)術(shù)出版?zhèn)惱硪?guī)范。 其內(nèi)容包括： 總的倫理原則，關(guān)于編輯的倫理原則，關(guān)于審稿人的倫理原則，關(guān)于作者的倫理原則。[7] 在國內(nèi)，《第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報》編輯部制定了詳細(xì)具體的出版?zhèn)惱硪?guī)范，為中國的學(xué)術(shù)期刊的編輯出版樹立了榜樣。 《第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報出版?zhèn)惱硪?guī)范》包括四個方面的內(nèi)容： 作者倫理，審稿人倫理，編輯倫理，出版者倫理。[8]

1.2.5 透射電子顯微鏡(TEM)分析 對數(shù)期的USA300菌液中加入松蘿酸，使松蘿酸終質(zhì)量濃度為256 μg/mL，離心(4 500 r/min，10 min)后收集菌體.PBS緩沖液洗滌菌體沉淀2次后用20倍體積的Gluta固定液(電鏡專用，2.5%)4 ℃固定10 h.固定后的菌體按透射電鏡樣品制備方法制樣[20-21]，于HT7700透射電鏡(電壓120 kv)放大10 000倍觀察菌體形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化[22-23].其他條件不變，以不加藥組作為對照組.

1.2.6 松蘿酸對USA300菌體生物被膜形成的影響 采用結(jié)晶紫染色法測定生物被膜[24].挑取USA300菌落接種至試管中，在37 ℃靜置培養(yǎng)10 h，菌液按2%分別接種在含有0、8、16、32、64 μg/mL松蘿酸的BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至108CFU/mL.然后分別取10 μL菌液和290 μL含有3%蔗糖(W/V)BHI液體培養(yǎng)基在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(平底)中37 ℃厭氧靜置培養(yǎng)18 h；移除上層液體和浮游細(xì)菌后，用PBS洗滌2次；再加入10%的甲醛溶液100 μL，室溫靜置10 h；移除甲醛溶液，用100 μL的0.1%的結(jié)晶紫溶液染色30 min；用超純水沖洗，室溫干燥；加入33%冰醋酸200 μL，充分混勻后測其在490 nm的吸光度，以吸光度反映菌株生物被膜的形成能力.

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復(fù)3次，采用Prism 7.0對數(shù)據(jù)差異顯著性分析進(jìn)行分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 松蘿酸對USA300生長的影響

松蘿酸對USA300的MIC為128 μg/mL，MBC為512 μg/mL.由圖1可知，松蘿酸質(zhì)量濃度為128、256 μg/mL的條件下，USA300生長被抑制；當(dāng)松蘿酸質(zhì)量濃度為64 μg/mL時，USA300在對數(shù)生長初期受到輕微的影響；而濃度為8、16、32 μg/mL時，USA300生長幾乎沒有影響.

2.2 松蘿酸對細(xì)胞膜和細(xì)胞壁通透性的影響

為探究松蘿酸對USA300細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)的影響，本試驗對加入松蘿酸后泄露的大分子物質(zhì)(DNA)的含量進(jìn)行了測定，結(jié)果如表1所示.松蘿酸作用1 h后，256 μg/mL松蘿酸處理組DNA含量比對照組增加(46.73±3.32) ng/μL(P<0.01)，證明松蘿酸可以改變USA300細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的通透性.

2.3 松蘿酸對USA300菌體可溶性蛋白質(zhì)代謝的影響

SDS-PAGE結(jié)果顯示，對照組條帶(圖2，條帶1、3)是清晰明亮的，而給藥組條帶(圖2，條帶2、4)是模糊暗淡的，且這些變化呈時間依賴性.在蛋白分子量為50～100 ku區(qū)間松蘿酸給藥組條帶明顯變淺，在20～25 ku區(qū)間松蘿酸給藥組條帶基本消失(圖2，矩形).BCA蛋白濃度測定試劑盒測定結(jié)果顯示，加入256 μg/mL松蘿酸2、6 h后松蘿酸給藥組的菌體中可溶性蛋白總量分別比對照組減少(4.59±0.93)%(P<0.05)、(13.36±3.11)%(P<0.05).結(jié)果表明，松蘿酸可以通過影響USA300菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝發(fā)揮其抑菌作用，且呈時間依賴性.

圖1 不同質(zhì)量濃度的松蘿酸對USA300在BHI液體培養(yǎng)基中生長的影響Figure 1 Effect of usnic acid at different concentrations on the growth of USA300 in BHI liquid medium

表1 松蘿酸對USA300菌體外滲DNA含量的影響Table 1 The effect of usnic acid on the DNA exosmosis amount of USA300

“**”表示差異極顯著(P<0.01).

“**” indicates the highly significant differences(P<0.01).

2.4 松蘿酸對USA300 LDH含量的影響

試驗結(jié)果顯示，加入松蘿酸4 h內(nèi)，LDH含量沒有明顯變化.給藥6 h后，給藥組LDH含量與對照組相比減少(198.8±4.2) U/L(P<0.05)，到8 h時，減少量增加至(244.1±10.3) U/L(P<0.05).試驗結(jié)果表明，松蘿酸能有效抑制USA300的LDH的產(chǎn)生，且呈時間依賴性.

2.5 松蘿酸對USA300菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡結(jié)果顯示對照組MRSA細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰，形態(tài)飽滿，邊緣清晰，分裂正常，具有清晰的二分裂期分裂縊痕(圖3-A、B).經(jīng)256 μg/mL松蘿酸作用10 h后，細(xì)胞有輕微的變形，邊緣模糊，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜出現(xiàn)損傷(圖3-C).松蘿酸處理16 h后，細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重變形，邊緣粗糙，細(xì)胞壁變厚，細(xì)胞質(zhì)固縮，出現(xiàn)一些小的空泡，細(xì)胞嚴(yán)重受損(圖3-D).說明松蘿酸能破壞細(xì)胞壁.

M：Maker；1：2 h對照組；2：2 h給藥組；3：6 h對照組；4：6 h給藥組.M：Maker；1：2 h control group；2：2 h drug group；3：6 h control group；4：6 h drug group.圖2 松蘿酸對USA300菌體蛋白質(zhì)代謝的影響Figure 2 The effect of usniacin on the protein synthesis of USA300

表2 松蘿酸對USA300 LDH含量的影響

“**”表示差異極顯著(P<0.01).

“**” indicates the highly significant differences(P<0.01).

A：10 h對照組；B：16 h對照組；C：10 h給藥組；D：16 h給藥組.A：10 h control group;B:16 h control group;C：10 h drug group;D:16 h drug group.圖3 松蘿酸對USA300菌體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響Figure 3 The effect of usnic acid on the microscopic structure of USA300

2.6 亞抑菌濃度松蘿酸對USA300生物被膜形成的影響

亞抑菌濃度是指低于最小抑菌濃度的藥物濃度.生物被膜試驗結(jié)果顯示，給藥組OD490值均小于對照組(圖4).其中64 μg/mL松蘿酸對生物被膜的形成影響最大.經(jīng)64 μg/mL松蘿酸處理后，USA300生物被膜總量相比對照組減少(85.85±2.19)%(P<0.01).而經(jīng)8、16、32 μg/mL松蘿酸處理后，USA300生物被膜總量比對照組減少(37.65±7.60)%(P<0.01)、(46.68±6.54)%(P<0.01)、(51.85±7.00)%(P<0.01).試驗結(jié)果表明，松蘿酸能有效抑制USA300生物被膜的形成，且呈濃度依賴性.

3 討論

MRSA是醫(yī)院感染的主要病原菌之一[25-26].敏感性試驗表明松蘿酸對USA300具有良好的抑菌作用，說明松蘿酸具有開發(fā)為抗MRSA感染藥物的潛力.

許多植物提取物通過破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響細(xì)胞功能發(fā)揮抗菌作用[27-28].透射電鏡結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞形態(tài)正常，與文獻(xiàn)報道一致[21].松蘿酸處理組則出現(xiàn)細(xì)胞變形，細(xì)胞壁、胞膜破損，細(xì)胞質(zhì)固縮，說明松蘿酸對MRSA的抗菌作用是通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)外流.

細(xì)胞膜為細(xì)胞的生命活動提供相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，同時與外環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換、能量交換和信息交換[29].細(xì)胞膜的損傷會使細(xì)胞質(zhì)外流，嚴(yán)重影響菌體的新陳代謝[30].細(xì)菌細(xì)胞壁具有保護(hù)菌體、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和參與致病過程等作用[31].細(xì)胞壁的損傷會影響其生長、形態(tài)和抵抗外界環(huán)境的能力等[29].DNA是重要的遺傳物質(zhì)，屬于生物大分子，幾乎不會通過滲透作用穿過細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，當(dāng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整時，培養(yǎng)液中幾乎不能檢測到DNA.試驗中泄露的DNA含量增多，說明細(xì)胞膜和細(xì)胞壁遭到破壞.在給藥后1 h內(nèi)，溶液中DNA含量迅速增加，說明松蘿酸發(fā)揮藥效迅速；第2 h給藥組DNA含量有少量增加，說明松蘿酸持續(xù)破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁；2～4 h的DNA含量未見明顯變化，說明細(xì)菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁已完全被破壞.總之，細(xì)胞內(nèi)的DNA泄漏試驗表明松蘿酸可以改變USA300菌株的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的通透性.

蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)具有一系列的功能，包括催化代謝反應(yīng)、復(fù)制DNA和對刺激做出反應(yīng)等[32].可溶性蛋白在細(xì)菌內(nèi)發(fā)揮滲透調(diào)節(jié)、催化反應(yīng)和營養(yǎng)儲存等作用[33-35].本試驗結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)過松蘿酸處理后的菌體內(nèi)可溶性蛋白總量顯著減少，可能是由于細(xì)胞膜受到破壞，導(dǎo)致細(xì)菌失去相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，同時細(xì)胞質(zhì)大量外流，新陳代謝失去反應(yīng)條件，最終表現(xiàn)為可溶性蛋白含量減少.說明松蘿酸可以干擾菌體內(nèi)可溶性蛋白的代謝，同時證明松蘿酸可以影響細(xì)菌的滲透平衡.

LDH催化丙酮酸和乳酸的相互轉(zhuǎn)化[36]，對于金黃色葡萄球菌保持毒力、逃避宿主的先天性免疫以及生物被膜形成是至關(guān)重要的[37-38].LDH試驗結(jié)果表明隨著時間的延長，細(xì)胞內(nèi)LDH的含量不斷下降，這可能是細(xì)胞膜破裂導(dǎo)致大量的LDH外流.松蘿酸能夠減少LDH的合成，說明松蘿酸在影響MRSA毒力，提高免疫響應(yīng)等方面大有可為.同時LDH 本質(zhì)上是一種可溶性蛋白質(zhì)，所以它的減少與可溶性蛋白試驗結(jié)果一致.

由于藥物進(jìn)入機(jī)體后不同組織分布差異極大，藥物濃度會隨著時間不斷降低.所以探究亞抑菌濃度下松蘿酸對MRSA的影響非常必要.生物被膜是吸附于惰性或活性材料表面的微生物群落，它會造成細(xì)菌的生理性耐藥[39].在臨床上，生物被膜是細(xì)菌在慢性感染和導(dǎo)尿管、假關(guān)節(jié)等醫(yī)療器械引起的感染的罪魁禍?zhǔn)譡40].金黃色葡萄球菌感染通常起源于最先的無癥狀定殖，而在定殖過程中生物被膜扮演著重要的角色[41-42].它通常粘附在細(xì)胞或材料表面并保護(hù)細(xì)菌逃避免疫系統(tǒng)[43].因此針對慢性MRSA感染和植入性醫(yī)療器械感染要以生物被膜為治療靶標(biāo).生物被膜試驗結(jié)果表明亞抑菌濃度松蘿酸可以有效抑制USA300生物被膜的形成，說明當(dāng)松蘿酸進(jìn)入機(jī)體被代謝成較低濃度時，仍然可以干擾MRSA的定殖并使MRSA暴露在免疫系統(tǒng)的監(jiān)控中.同時松蘿酸通過抑制MRSA生物被膜的形成減少耐藥性的產(chǎn)生.

4 結(jié)論

松蘿酸可以通過改變細(xì)胞膜的通透性，破壞菌體細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的完整性、干擾菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝等途徑來抑制USA300的生長繁殖，并在亞抑菌濃度抑制細(xì)菌生物被膜的形成.關(guān)于其他的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究.同時本研究表明，松蘿酸可能是治療MRSA感染的潛在藥物，但有必要對動物模型進(jìn)行療效和毒性評價以指導(dǎo)臨床應(yīng)用.