夏曉冬，賀濛初，舒迎霜，何嫣婷，馮士彬，李玉，王希春，吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

四君子湯是補(bǔ)養(yǎng)劑中補(bǔ)氣劑的經(jīng)典方劑，臨床上主治脾胃氣虛、運(yùn)化力弱病證[1].四君子湯的成分包括四種中藥，人參、茯苓、白術(shù)、炙甘草.多糖被認(rèn)為是四君子湯中最豐富的和主要的有效成分，研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯及其組分S-3粗多糖具有增強(qiáng)免疫功能的作用，且四君子湯的總多糖能促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖.四君子湯的藥理作用主要有興奮中樞，減輕疲乏感，調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌和能量代謝等[2-4]，對(duì)于脾虛引發(fā)的消化吸收功能障礙、腸道炎癥性疾病有很好的治療效果，可調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)紊亂、水代謝紊亂等.四君子湯能夠有效改善胰酶活性[5]，促進(jìn)胃腸消化[6]，調(diào)節(jié)腸道菌群的多樣性.近年來，中藥制劑因其自身優(yōu)勢(shì)[7]，被廣泛的應(yīng)用為飼料添加劑.表皮生長(zhǎng)因子(EGF)主要由頜下腺合成分泌，在胰腺、肝臟、十二指腸Brunner腺等組織器官中也有EGF的合成和分泌[7].EGF在刺激細(xì)胞增殖中起重要作用，能重塑組織，增加膠原蛋白和彈性蛋白[9-12].EGF與其受體的作用是黏膜上皮的增殖和遷移使?jié)兠嫔掀せ闹匾蛩豙13].生長(zhǎng)抑素(SS)是一種廣泛分布的抑制性腦腸肽，可抑制多種胃腸激素的釋放，減少胰腺的外分泌和膽汁分泌，抑制胃腸運(yùn)動(dòng)和膽囊收縮以及多種細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)[14].SS可降低血液中促胰島素及膽囊收縮素水平，也可經(jīng)體循環(huán)抑制腺泡細(xì)胞，從兩方面影響胰液的分泌，達(dá)到對(duì)食物分解速度調(diào)控的目的.

本試驗(yàn)在四君子湯基礎(chǔ)上加味黃芪、山楂等，研究該加味四君子湯對(duì)犬小腸吸收率、胰腺消化酶水平、腸道內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、生長(zhǎng)抑素(SS)表達(dá)的影響，旨在探討加味四君子湯對(duì)犬消化功能的作用及其機(jī)制，為加味四君子湯臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 1歲齡比格犬18只，由南京亞東試驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供.試驗(yàn)前進(jìn)行常規(guī)免疫與驅(qū)蟲，定量采食，自由飲水，隔離飼喂7 d.

1.1.2 試驗(yàn)主要器材與儀器 TD-100小型提取濃縮機(jī)組(浙江森力機(jī)械科技有限公司)，CX31正置光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，YD-1508 R輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠)，HPX-9082MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，DW-86L388A -80 ℃冰箱(青島海爾特種電器有限公司)，F(xiàn)SH-2可調(diào)高速勻漿機(jī)(金壇市科興儀器廠)，可控硅控溫水浴鍋(金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器)，微量移液器(Eppendaorf)，TGL-18R臺(tái)式高速離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，TU-1901紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司).

1.1.3 中藥材和試劑 加味四君子湯原材料(黨參、茯苓、炒白術(shù)、甘草、當(dāng)歸、黃芪、山楂等)購(gòu)于安徽合肥梅山路立方大藥房，D-木糖試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，胰蛋白酶試劑盒、胰脂肪酶試劑盒、胰淀粉酶試劑盒購(gòu)于購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，免疫組化一抗試劑購(gòu)自美國(guó)ImmunoWay生物技術(shù)有限公司(EGF抗體編號(hào)：YT1481，SS抗體編號(hào)：YT4365)，二抗試劑購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司(二抗編號(hào)：K183316A).

1.2 方法

1.2.1 中藥制備 加味四君子湯的制備：將中藥原料按一定比例組方[15]，清洗去除雜質(zhì)后連同清洗液投入提取罐中，料液比1∶10，浸泡3 h后提取2次，40 min/次，將2次提取液過濾后倒入濃縮罐濃縮成1 g/mL水煎劑，冷卻后4 ℃保存.

1.2.2 試驗(yàn)犬分組以及飼養(yǎng)管理 比格犬觀察一周均無不良反應(yīng)，將18只犬隨機(jī)分為3組，即A組、B組、C組，每組6只.試驗(yàn)期間，3組試驗(yàn)犬飼喂管理?xiàng)l件均一致，每日飼喂2次基礎(chǔ)日糧，每次150 g；根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置1%和2%加味四君子湯兩組添加劑量，即B組，飼糧中添加3 mL加味四君子湯；C組，飼糧中添加6 mL加味四君子湯.保證充足潔凈飲水，犬舍每日打掃1次.常規(guī)消毒、免疫.

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)以及樣本處理 分別在第0、7、14 d使用非抗凝采血管采集血樣5 mL靜置30 min，3 000 r/min離心20 min，用移液槍取上清液置于EP管，保存于4 ℃冰箱.采集小腸組織中段放入多聚甲醛固定液，常規(guī)石蠟包埋，切片，免疫組化后，光鏡觀察蛋白在腸道內(nèi)的表達(dá)情況，液氮中的小腸組織和胰腺組織放置于液氮速凍以后，保存于-80 ℃冰箱，用于測(cè)定mRNA相對(duì)表達(dá)量和胰腺消化酶水平.

1.2.4 D-木糖含量檢測(cè) 采用試劑盒測(cè)定血清中D-木糖含量，具體過程嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行.

1.2.5 胰腺中消化酶水平的測(cè)定 取0.5 g的胰腺組織，按照1∶9的比例加入4.5 mL生理鹽水,用組織勻漿機(jī)在冰浴下進(jìn)行充分勻漿，再經(jīng)過12 000 r/min離心30 min，取上清液于EP管中，保存于4 ℃.胰腺組織中胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶水平測(cè)定按照試劑盒說明書測(cè)定.

1.2.6 小腸各段EGF、SS蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用常規(guī)免疫組化的方法檢測(cè)小腸組織EGF、SS表達(dá)量，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，以PBS替代一抗，試驗(yàn)結(jié)束后用光鏡對(duì)免疫組化腸道進(jìn)行拍照，同一組織選擇3個(gè)視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖片進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以平均光密度值表示.

1.2.7 小腸各段EGF、SS的mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 利用Trizol法提取試驗(yàn)犬各段小腸組織的總RNA.將提取到的總RNA采用SuperScript III RT反轉(zhuǎn)錄kit試劑盒合成cDNA.依據(jù)GeneBank中EGF、SS及內(nèi)參actin的序列(GeneBank登錄號(hào)分別為XM_014109884.2和NM_001003307.1).利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1).使用Sybr qpcr mix試劑，采用ABI-7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小腸中EGF、SS mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果以2-ΔΔCt表示.

表1 用于PCR擴(kuò)增的引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 加味四君子湯對(duì)犬血清中D-木糖含量的影響

第0 d，各組差異均不顯著(P>0.05).第7、14天，與A組相比，B組血清中D-木糖含量無顯著差異(P>0.05)，C組血清中D-木糖含量顯著增加(P<0.05).與B組相比，C組血清中D-木糖含量顯著增加(P<0.05)，見表2.

2.2 加味四君子湯對(duì)犬胰腺消化酶水平的影響

與A組相比，B組3種消化酶水平均無顯著差異(P>0.05)，C組均顯著升高(P<0.05).與B組相比，C組3種消化酶水平均顯著升高(P<0.05).結(jié)果見表3.

2.3 加味四君子湯對(duì)犬小腸EGF陽(yáng)性表達(dá)水平的影響

IHC檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，棕黃色區(qū)域?yàn)殛?yáng)性表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)蘇木素復(fù)染，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)為淺藍(lán)色，細(xì)胞膜不著色.

由圖1可見，試驗(yàn)犬各腸段均有EGF蛋白表達(dá)，陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布在腸絨毛兩側(cè)以及腸腺周圍.圖2反映了試驗(yàn)犬小腸各段EGF陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值.由圖可知，十二指腸、空腸中，與A組相比，B、C組EGF陽(yáng)性表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；與B組相比，C組EGF陽(yáng)性表達(dá)量極顯著升高(P<0.01).回腸中，與A組相比，B、C組EGF陽(yáng)性表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；與B組相比，C組EGF陽(yáng)性表達(dá)量顯著升高(P<0.05).

1：十二指腸；2：空腸；3：回腸；Y：陰性對(duì)照；A：對(duì)照組；B：1%加味四君子湯組；C：2%加味四君子湯組1：duodenum；2：jejunum；3：ileum；Y：negative control；A：control group；B：1% supplementary Sijunzi decoction group；C：2% supplementary Sijunzi decoction group.圖1 犬小腸各段EGF陽(yáng)性表達(dá)水平(400×)Figure 1 The positive expression level of EGF in the small intestine of canines(400×)

2.4 加味四君子湯對(duì)犬小腸EGF的mRNA表達(dá)量的影響

十二指腸中，與A組相比，B組EGF mRNA相對(duì)表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)，B組犬腸道EGF mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；與A組相比，B組EGF mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01).空腸中，與A組相比，B湯組EGF mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，C組EGF mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；與B組相比，C組EGF mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01).回腸中，與A組相比，B、C組EGF mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；B組與C組EGF mRNA相對(duì)表達(dá)量無顯著差異(P>0.05，圖3).

表2 加味四君子湯對(duì)犬血清中D-木糖含量的影響

同行數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01).

In the same row,values with different small letter superscripts mean significance difference(P<0.05),and with different capital letter superscripts mean significance difference(P<0.01)．

同行數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01).

In the same row,values with different small letter superscripts mean significance difference(P<0.05),and with different capital letter superscripts mean significance difference(P<0.01)．

同一組織不同處理組相比，圖柱上標(biāo)相同字母或者不標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05)；上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；上標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01).Among different groups in the same tissue,the same or no letter superscripts indicate no significant difference(P>0.05);different small letter superscripts indicate significant difference(P<0.05);different capital letter superscripts indicate extremely significant difference(P<0.01).圖2 犬小腸各段EGF平均光密度值Figure 2 The density mean of EGF in the small intestine of canines

同一組織不同處理組相比，圖柱上標(biāo)相同字母或者不標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05)；上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；上標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01).Among different groups in the same tissue,the same or no letter superscripts indicate no significant difference(P>0.05);different small letter superscripts indicate significant difference(P<0.05);different capital letter superscripts indicate extremely significant difference(P<0.01).圖3 犬小腸各段EGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量Figure 3 The EGF mRNA relative expression values in the small intestine of the canines

2.5 加味四君子湯對(duì)犬小腸SS陽(yáng)性表達(dá)水平的影響

IHC檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，棕黃色區(qū)域?yàn)殛?yáng)性表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)蘇木素復(fù)染，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)為淺藍(lán)色，細(xì)胞膜不著色.

由圖4可見，試驗(yàn)犬各腸段均有SS蛋白表達(dá)，陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布在腸絨毛兩側(cè)以及腸腺周圍.圖5反映了試驗(yàn)犬小腸各段SS陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值.由圖可知，十二指腸中，與A組相比，B、C組SS陽(yáng)性表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；與B組相比，C組SS陽(yáng)性表達(dá)量極顯著降低(P<0.01).空腸中，與A組相比，B組SS陽(yáng)性表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)，C組SS陽(yáng)性表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；與B組相比，C組SS陽(yáng)性表達(dá)量極顯著降低(P<0.01).回腸中，與A組相比，B組SS陽(yáng)性表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，C組SS陽(yáng)性表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；與B組相比，C組SS陽(yáng)性表達(dá)量極顯著降低(P<0.01).

2.6 加味四君子湯對(duì)犬小腸SS的mRNA表達(dá)量的影響

十二指腸中，與A組相比，B、C組SS mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01)；與B組相比，C組犬腸道中SS mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01).空腸中，與A組相比，B組SS mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，C組SS mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；與B組相比，C組SS mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05).回腸中，與A組相比，B、C組SS mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；與B組相比，C組SS mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，結(jié)果見圖6.

1：十二指腸；2：空腸；3：回腸；Y：陰性對(duì)照；A：對(duì)照組；B：1%加味四君子湯組；C：2%加味四君子湯組.1：duodenum；2：jejunum；3：ileum；Y：negative control；A：control group；B：1% supplementary Sijunzi decoction group C:2% supplementary Sijunzi decoction group.圖4 試驗(yàn)犬小腸各段SS陽(yáng)性表達(dá)水平(400×)Figure 4 The positive expression level of SS in the small intestine of the experimental canines(400×)

同一組織不同處理組相比，圖柱上標(biāo)相同字母或者不標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05)；上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；上標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01).Among different groups in the same tissue,the same or no letter superscripts indicate no significant difference(P>0.05);different small letter superscripts indicate significant difference(P<0.05);different capital letter superscripts indicate extremely significant difference(P<0.01).圖5 試驗(yàn)犬小腸各段SS平均光密度值Figure 5 The density mean of SS in the small intestine of canines

3 討論

3.1 加味四君子湯對(duì)犬血清D-木糖的影響

D-木糖為右旋戊醛糖，不被腎小管重吸收，一部分經(jīng)空腸黏膜上皮細(xì)胞進(jìn)入血液，另一部分會(huì)迅速排入尿液中.在灌服一定量的D-木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液后，間隔1 h對(duì)血液中的D-木糖含量進(jìn)行測(cè)定，可評(píng)判胃腸道被動(dòng)吸收能力的強(qiáng)弱.內(nèi)服D-木糖后在小腸內(nèi)以易化擴(kuò)散的方式吸收，不需要耗能但與腸道黏膜完整度呈正比.加味四君子湯中含有多種抗氧化成分能消除細(xì)胞組織中自由基，具有提高機(jī)體抗氧化損傷機(jī)能，保護(hù)生物膜正常結(jié)構(gòu)，有助于維持小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，改善犬小腸的吸收功能[16].韓凌等[17]研究結(jié)果表明，加味四君子湯中的多糖成分可能作用于小腸上皮細(xì)胞.小腸是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場(chǎng)所，腸道黏膜上皮細(xì)胞在吸收作用中扮演著重要的角色.本試驗(yàn)中2%加味四君子湯組與對(duì)照組犬相比，血清中D-木糖含量顯著增加(P<0.05)，說明加味四君子湯可提高犬腸道吸收能力.

同一組織不同處理組相比，圖柱上標(biāo)相同字母或者不標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05)；上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；上標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01).Among different groups in the same tissue,the same or no letter superscripts indicate no significant difference(P>0.05);different small letter superscripts indicate significant difference(P<0.05);different capital letter superscripts indicate extremely significant difference(P<0.01).圖6 犬小腸各段SS mRNA的相對(duì)表達(dá)量Figure 6 The SS mRNA relative expression values in the small intestine of canines

3.2 加味四君子湯對(duì)犬胰腺消化酶的影響

胰腺是動(dòng)物機(jī)體一個(gè)具有外分泌、內(nèi)分泌的腺體，外分泌的作用主要是分泌胰液，進(jìn)入十二指腸從而發(fā)揮相應(yīng)作用[18].促胰液素和膽囊收縮素是體液調(diào)節(jié)的2個(gè)重要激素，分別促進(jìn)和抑制胰液的分泌.胰腺消化酶活性在一定程度上反應(yīng)了動(dòng)物機(jī)體的消化能力[19].本試驗(yàn)表明，加味四君子湯組犬胰腺組織中淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶活性較對(duì)照組犬顯著升高，加味四君子湯能提高犬胰腺消化酶活性，增強(qiáng)犬消化功能.

3.3 加味四君子湯對(duì)犬腸道EGF蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

小腸黏膜上皮的完整度與消化吸收功能呈正相關(guān)[20-21].有研究表明，腸道上皮細(xì)胞的增殖和維持是由EGF的信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控[22].目前，大量相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究表明EGF與胃腸道疾病有密切關(guān)系.EGF具有促細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、傷口愈合及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)功能.本試驗(yàn)在犬飼料中添加加味四君子湯后，分析免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組犬，加味四君子湯組犬小腸絨毛頂部及腸腺周圍的EGF蛋白水平顯著提高(P<0.05)，2%加味四君子湯組試驗(yàn)犬腸道中EGF蛋白含量增加尤為顯著；熒光定量PCR檢測(cè)的結(jié)果也表明，在轉(zhuǎn)錄水平上加味四君子湯組犬腸道中EGF的mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯增加.兩個(gè)檢測(cè)結(jié)果一致，說明加味四君子湯能增加犬腸道內(nèi)EGF的含量，有利于維護(hù)腸道黏膜的完整性，保護(hù)和促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育[23].

3.4 加味四君子湯對(duì)犬腸道SS蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

消化道的SS主要是由黏膜內(nèi)D細(xì)胞分泌，有SS14和SS282種，大多分布在胃腸道和胰島中.機(jī)體內(nèi)注射SS后，胰液分泌減少，PH值改變，胰腺消化酶活性降低.迷走、膽堿能、腎上腺素能神經(jīng)等可調(diào)控SS的基礎(chǔ)釋放，如M型膽堿能神經(jīng)興奮可刺激犬SS分泌.鐘學(xué)軍等[24]在模擬+Gz值暴露下形成的大鼠胃黏膜損傷研究SS含量變化，結(jié)果表明SS含量與胃黏膜損傷程度成正比.本試驗(yàn)通過免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加加味四君子湯后試驗(yàn)組犬腸道中SS蛋白水平較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)；熒光定量PCR檢測(cè)的結(jié)果也表明，在轉(zhuǎn)錄水平上添加加味四君子湯組犬與對(duì)照組犬相比，SS的mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)，與免疫組化結(jié)果基本一致.

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，加味四君子湯可以顯著提高EGF蛋白表達(dá)量以及mRNA含量，顯著降低SS蛋白表達(dá)量以及mRNA含量.在飼糧添加2%加味四君子湯能顯著增加犬血清中D-木糖含量及胰腺中脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶的含量，增強(qiáng)犬的消化吸收功能.