時(shí) 華 涂 悅 王振國(guó) 吳煥成 劉 洋

(武警特色醫(yī)學(xué)中心1 神經(jīng)外一科，2 腦科中心，天津市 300162，電子郵箱：liq_doc@163.com；3 天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津市 300070；4 上海市第四人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海市 200081)

近年來，隨著交通運(yùn)輸及經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，顱腦創(chuàng)傷的發(fā)生率逐年升高，尤其是重型顱腦損傷(severe traumatic brain injury,STBI)患者，死亡率和致殘率居高不下，總死亡率可達(dá)30%～50%[1-2]。雖然國(guó)內(nèi)針對(duì)顱腦損傷的基礎(chǔ)及臨床研究不斷深化，治療效果顯著提高，但仍有諸多問題亟待解決，特別是STBI后腦水腫、線粒體的功能障礙，遲發(fā)性神經(jīng)元損傷等繼發(fā)性損傷的防治[3]。病理過程的復(fù)雜也導(dǎo)致目前尚無針對(duì)顱腦損傷治療的藥物。盡管制藥公司投資了數(shù)十億美元用于STBI相關(guān)藥物的研發(fā)，但至今仍沒有明確有效的藥物可用于顱腦損傷急性期的治療[4]。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)是一種普遍存在的嘧啶核苷酸，近期有研究顯示，其可通過調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用，激活沉默信息調(diào)節(jié)因子通路，并改善線粒體功能，從而延長(zhǎng)酵母、果蠅和小鼠的壽命[5-6]。NAD是否可以改善顱腦損傷后的神經(jīng)損傷癥狀，發(fā)揮腦保護(hù)作用，值得探討。目前，目標(biāo)體溫管理(targeted temperature management，TTM)仍用于STBI的治療，且合理應(yīng)用時(shí)其療效十分可觀[7]。有研究表明，STBI患者進(jìn)行TTM的預(yù)后良好率為68.9%，而溫度控制不佳的STBI患者預(yù)后良好率僅為46.7%[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬基于線粒體生物合成機(jī)制，探索NAD聯(lián)合TTM治療對(duì)STBI神經(jīng)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠60只購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK-(軍)2007-04]，7～8周齡，體質(zhì)量220～250 g，4只/籠，每日光照12 h，自由飲食。

1.2 儀器與試劑 3001L電子腦皮質(zhì)撞擊儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)，W18Cr4V型高速磨鉆(韓國(guó)SUESHIN公司)，WSS-100型電干燥/恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司)，SCSP-502型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)，ZLJ-2000Ⅱ亞低溫治療儀(長(zhǎng)春安泰有限責(zé)任公司)。NAD、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、丙二醛檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司(批號(hào)：A114-1-1、H052、A003-4-1)，兔抗小鼠受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1,RIP1)、中樞神經(jīng)特異性蛋白S100β、 水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)、緊密橋接蛋白(tight junction protein,TJP)單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology 公司(批號(hào)：ab50031、ab10277、ab34119、ab213651)，煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)購(gòu)自上海署燦實(shí)業(yè)公司(批號(hào)：37120-17-1)。

1.3 STBI模型的制備 將60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組48只、對(duì)照組12只。模型組構(gòu)建STBI模型[9]：給予大鼠腹腔注射青霉素10萬單位，隨后給予 5%水合氯醛(7 mL/kg)腹腔注射麻醉，鉆孔開顱骨窗后將大鼠固定于打擊平臺(tái)上；調(diào)整電子腦皮質(zhì)撞擊儀的打擊臂使其與垂直方向呈20°的夾角，使用3 mm打擊帽，使打擊面與腦皮質(zhì)表面基本平行并精確打擊大鼠大腦皮層；按最低點(diǎn)持續(xù)時(shí)間均為200 ms，4 mm的打擊深度，5 m/s的打擊速度構(gòu)建重度STBI大鼠模型。打擊完成后用浸濕生理鹽水的棉球止血，隨后縫合皮膚。對(duì)照組則不進(jìn)行任何操作。術(shù)后若出現(xiàn)死亡則增補(bǔ)相應(yīng)數(shù)量的大鼠。

1.4 干預(yù)方法 在完成造模后，將48只STBI大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，即STBI組、STBI+TTM組(S+T組)、STBI+NAD組(S+N組)、STBI+TTM+NAD組(S+T+N組)，每組12只。將NAD的前體NMN溶于生理鹽水中，配制成5%濃度的溶液。S+T組和S+T+N組在STBI后行TTM治療，具體方法如下：連接亞低溫治療儀后，設(shè)定冰毯溫度為7℃，時(shí)程設(shè)定為6 h，在STBI后10 min，將大鼠置于冰毯上，約20 min后肛溫達(dá)到33℃～34℃時(shí)，每間隔30 min測(cè)1次溫度以保持體溫維持在亞低溫水平。S+N組和S+T+N組大鼠按照500 mg/kg的劑量，于造模后第2天起每日8時(shí)和18時(shí)腹腔注射NMN，STBI組及S+T組大鼠于同一時(shí)間注射同等劑量的生理鹽水，均連續(xù)7 d。治療結(jié)束后，將大鼠放入室溫環(huán)境以緩慢復(fù)溫。對(duì)照組大鼠不進(jìn)行任何處理。

1.5 行為學(xué)評(píng)分 于最后一次腹腔注射操作后12 h，按照Chen等[10]的方法對(duì)大鼠進(jìn)行改良神經(jīng)功能損傷量表(Modified Neurological Severity Scale,mNSS)評(píng)分，神經(jīng)功能損傷癥狀越嚴(yán)重則分?jǐn)?shù)越高。正常為0分，損傷最嚴(yán)重時(shí)為18分。

1.6 腦水腫程度評(píng)定 待上述實(shí)驗(yàn)完成后，頸椎離斷法處死大鼠，每組隨機(jī)選取3只大鼠，取出腦組織并去除延髓及以下部分，立即稱重，記錄所得質(zhì)量(濕重)。隨后將腦組織放入烘干箱中，70℃烘烤48 h，再次稱重并記錄所得質(zhì)量(干重)，腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 每組再隨機(jī)選取3只大鼠，切取損傷側(cè)同一部位組織標(biāo)本，分別稱取重量50 mg，滴加入1 mL的磷酸緩沖鹽溶液，用超聲破碎儀將標(biāo)本勻漿，以2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)NAD、丙二醛、TNF-α水平，按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.8 免疫印跡試驗(yàn) 取各組剩余大鼠的腦組織，用4℃的無菌生理鹽水輕輕洗去腦組織表面的血液，取大鼠損傷部位周邊腦組織50 mg(對(duì)照組取同一側(cè)腦組織)并置于1.5 mL離心管中，充分破碎腦組織。提取蛋白后采用免疫印跡試驗(yàn)法檢測(cè)S100β蛋白、AQP4、TJP水平，按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 5組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分比較 與對(duì)照組比較，其余各組大鼠的mNSS評(píng)分均升高(均P<0.05)；S+T組、S+N組、S+T+N組的mNSS評(píng)分均低于STBI組，且S+T+N組的評(píng)分均低于S+T組、S+N組(均P<0.05)。見表1。

2.2 5組大鼠腦水腫程度比較 STBI組和S+N組大鼠的腦組織含水量均高于對(duì)照組；而S+T+N組腦組織含水量低于STBI組(P<0.05)，且與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但S+T組、S+N組與STBI組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 5組大鼠mNSS評(píng)分及腦組織含水量比較(x±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與STBI組比較，#P<0.05；與S+T+N組比較，▲P<0.05。

2.3 5組大鼠腦組織各因子水平比較 S+N組、S+T+N組NAD水平均高于對(duì)照組及STBI組，且S+T+N組NAD水平高于S+T組(均P<0.05)。STBI組、S+T組、S+N組的丙二醛、TNF-α水平均高于對(duì)照組；S+T+N組丙二醛、TNF-α水平均低于STBI組，且TNF-α水平低于S+T組和S+N組(均P<0.05)，但S+T組和S+N組的丙二醛、TNF-α水平與STBI比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 5組大鼠腦組織各因子水平比較(x±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與STBI組比較，#P<0.05；與S+T+N組比較，▲P<0.05。

2.4 5組大鼠腦組織S100β蛋白、AQP4和TJP表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，其余4組大鼠腦組織的S100β蛋白、AQP4和TJP表達(dá)水平升高；而與STBI組比較，S+N組和S+T組大鼠腦組織的S100β和AQP4蛋白表達(dá)水平降低，S+T+N組S100β、AQP4和TJP表達(dá)水平均降低(均P<0.05)；S+T+N組S100β和TJP表達(dá)水平均低于S+N組和S+T組(均P<0.05)。見圖1及表3。

圖1 5組大鼠S100β蛋白、AQP4和TJP表達(dá)情況

組別nS100βAQP4TJPSTBI組61.70±0.07?0.83±0.10?1.13±0.07?S+T組61.52±0.07?#▲0.59±0.06?#1.06±0.09?▲S+N組61.23±0.10?#▲0.64±0.04?#1.05±0.10?▲S+T+N組61.01±0.10?#0.57±0.02?#0.88±0.04?#對(duì)照組60.65±0.050.49±0.020.56±0.04 F值81.99815.40130.213P值<0.001<0.001<0.001

注： 與對(duì)照組比較，*P<0.05；與STBI組比較，#P<0.05；與S+T+N組比較，▲P<0.05。

3 討 論

腦水腫是顱腦損傷后常見并發(fā)癥，常于發(fā)病后第2天達(dá)到高峰，這主要是由于創(chuàng)傷引起的腦組織缺血、缺氧以及Na+-K+離子泵的功能障礙可導(dǎo)致細(xì)胞水腫，其可造成顱內(nèi)壓急劇增高，從而進(jìn)一步使腦的血液灌注減少，加重病情，甚至導(dǎo)致腦疝威脅患者生命[11]。沈彤等[9]發(fā)現(xiàn)，大鼠的顱腦損傷程度越嚴(yán)重，腦含水量越高；黃紅潔等[12]也發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷可加重腦水腫的形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，STBI組大鼠腦含水量升高，且mNSS評(píng)分下降(P<0.05)，這提示STBI后可出現(xiàn)持續(xù)的腦水腫，而這或可加重神經(jīng)功能的損傷。究其原因，一方面，STBI后大鼠腦組織內(nèi)丙二醛、TNF-α表達(dá)水平升高(P<0.05)，表明STBI加重了腦組織的炎癥及氧化應(yīng)激水平，從而進(jìn)一步加重了神經(jīng)功能的損傷。黃樹宣等[13]也發(fā)現(xiàn)STBI小鼠雙側(cè)丘腦的炎癥細(xì)胞增加，且李峰等[14]也發(fā)現(xiàn)STBI患者急性期氧化應(yīng)激平衡改變和炎癥反應(yīng)標(biāo)志物過表達(dá)，這些均不利于神經(jīng)功能恢復(fù)；同時(shí)，較高的炎癥及氧化應(yīng)激水平還可造成線粒體損傷，減少腦組織的氧供，加重腦水腫及神經(jīng)功能損傷。另一方面，STBI大鼠腦組織水通道相關(guān)蛋白S100β、AQP4和TJP的表達(dá)水平升高(P<0.05)，這增加了血腦屏障通透性，也進(jìn)一步促進(jìn)了腦水腫的發(fā)生。

NAD是一種普遍存在的嘧啶核苷酸，可減弱新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元DNA的氧化損傷[5]，外源性補(bǔ)充NAD可有效地保護(hù)氧化應(yīng)激造成的神經(jīng)元的凋亡[15]。由于直接攝入NAD會(huì)導(dǎo)致NAD在肝臟內(nèi)被滅活，無法達(dá)到補(bǔ)充NAD的目的[16-17]，故本實(shí)驗(yàn)采用NAD的前體NMN來補(bǔ)充體內(nèi)NAD水平。TTM是指將患者核心體溫降低至特定溫度以修復(fù)或減輕由血液灌注不足導(dǎo)致的組織損傷。研究表明，體溫每下降1℃，腦組織代謝率降低6%～7%，氧代謝率下降6%～9%[18]，適度降低體溫可有效延緩大腦能量?jī)?chǔ)備耗竭。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，S+T組、S+N組、S+T+N組大鼠的mNSS評(píng)分均低于STBI組，且S+T+N組的評(píng)分均低于S+T組、S+N組(均P<0.05)，提示單純應(yīng)用NAD或TTM，以及兩者聯(lián)合應(yīng)用均可改善STBI大鼠的神經(jīng)損傷癥狀，而聯(lián)合應(yīng)用的效果更佳。同時(shí)，S+T+N組腦組織含水量低于STBI組(P<0.05)，且與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但S+T組、S+N組與STBI組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。此外，S+T+N組丙二醛、TNF-α、S100β蛋白、AQP4和TJP表達(dá)水平均低于STBI組，且TNF-α、S100β蛋白和TJP表達(dá)水平低于S+T組和S+N組(均P<0.05)，提示將NAD與TTM合用，還可降低TNF-α水平，并更好地抑制血腦屏障通透性相關(guān)蛋白S100β和TJP的表達(dá)，改善血腦屏障通透性從而更好地抑制腦水腫的形成。這一定程度上可以降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平，減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生以及鈣內(nèi)流等多種不良效應(yīng)，緩解線粒體功能障礙以及細(xì)胞膜的破裂，同時(shí)抑制炎癥因子、中性粒細(xì)胞的滲入及功能，減輕炎癥反應(yīng)[18]。

綜上所述，STBI后，NAD和TTM聯(lián)用可有效發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)一步降低炎癥及氧化應(yīng)激水平，減少血腦屏障通透性，減輕腦水腫，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，這或可為日后臨床治療STBI提供了新策略。