劉愛鳳 馬小華

(湖南省長沙市中心醫(yī)院1 病理科，2 檢驗(yàn)科，長沙市 410004，電子郵箱：530511393@qq.com)

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)為又稱為非典型分枝桿菌，是除結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌以外的分枝桿菌的總稱，屬于條件致病菌[1-2]。根據(jù)其生長速度的不同，將其分為快速生長分枝桿菌和慢速生長分枝桿菌。不同的NTM菌種感染其臨床治療方案不盡相同[3]，而NTM對大多數(shù)一線抗結(jié)核藥物高度耐藥[4-5]，因此，對NTM進(jìn)行菌種鑒定對選擇有效的抗結(jié)核藥物尤為重要。本研究探討龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌和偶然分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室診斷的方法，以及阿米卡星和左氧氟沙星對這兩類快速生長型分枝桿菌體外抑菌的情況，為臨床制定治療方案提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 21株龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌和10株偶然分枝桿菌均來自本院實(shí)驗(yàn)室保存的臨床分離株。結(jié)核分枝桿菌H37Rv用于抗酸染色陽性對照，大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌用于革蘭染色質(zhì)量控制。

1.2 主要儀器和試劑 菌種基因芯片、ExtractorTM36核酸快速提取儀、BioMixerTMⅡ芯片雜交儀、Slider WasherTM8芯片洗干儀和LuScan10K-B微陣列芯片掃描儀均購自北京博奧生物有限公司；FX-1200-B2生物安全柜購自上海瑞仰凈化裝備有限公司；96孔板購自美國Corning公司；硫酸阿米卡星(批號：8H1633c24)購自齊魯制藥有限公司，左氧氟沙星(批號：D1823022)購于上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 羅氏培養(yǎng)法培養(yǎng)分枝桿菌 痰標(biāo)本中加入1～2倍體積4% NaOH，震蕩混勻后靜置15～20 min，加入磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)至45 mL，于4℃ 3 000 r/min離心15 min，棄上清，加入0.5 mL 0.9%生理鹽水，混勻，即為痰標(biāo)本的處理液，吸取0.1 mL樣本處理液置于改良羅氏培養(yǎng)基斜面進(jìn)行培養(yǎng)接種，接種后第3天開始觀察結(jié)果。如為陽性則進(jìn)行抗酸染色，并挑取菌落進(jìn)行基因芯片檢測。

1.4 基因芯片法鑒定分枝桿菌菌種基因 菌種基因操作參考文獻(xiàn)[6]：(1)DNA提?。簭纳鲜龈牧剂_氏培養(yǎng)基中挑取培養(yǎng)陽性菌株，調(diào)整細(xì)菌菌液濃度約1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝坏募?xì)菌懸液，取20 μL置于核酸提取管中，加入80 μL的核酸裂解液，充分混勻震蕩10 min，置于100℃金屬浴10 min，12 000 r/min離心1 min，所得的上清即為待測模版。(2)基因擴(kuò)增：將菌種基因芯片擴(kuò)增試劑復(fù)溫，取18 μL加入八連管中，再加入待測模版2 μL，于ABI7300擴(kuò)增儀中擴(kuò)增，擴(kuò)增條件設(shè)為：37℃ 600 s；94℃ 600 s；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，72℃ 60 s，共10個(gè)循環(huán)；最后72℃ 420 s延伸。(3)基因雜交：將擴(kuò)增產(chǎn)物放入95℃變性5 min，再置于-20℃ 5 min，即得到待測產(chǎn)物。將雜交緩沖液與基因擴(kuò)增產(chǎn)物按9 ∶6的體積比例混合，取13.5 μL混合液加入雜交芯片的加樣孔中，置入芯片雜交儀，50℃雜交2 h。雜交完成后，洗滌、干燥、掃描產(chǎn)物，然后分析結(jié)果。

1.5 阿米卡星、左氧氟沙星對龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌和偶然分枝桿菌的最小抑菌濃度測定 阿米卡星和左氧氟沙星對細(xì)菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的檢測方法參考《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[7]。(1)菌懸液制備：用無菌棉簽挑取1.3培養(yǎng)的對數(shù)生長期的細(xì)菌加入3 mL生理鹽水中，超聲磨菌后將細(xì)菌調(diào)整為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)懸液，再用0.9%生理鹽水進(jìn)行100倍稀釋，即為待測細(xì)菌懸液。(2)含藥微孔板制備參考文獻(xiàn)[8]：① 取96孔板，加入100 μL含10% 分枝桿菌營養(yǎng)添加劑(含油酸，白蛋白，葡萄糖和過氧化氫酶)的7H9培養(yǎng)液(美國BD公司，批號：8004943)；② 在最高檢測孔(進(jìn)行倍比稀釋之前的最高藥物濃度檢測孔)中再加入80 μL含10%分枝桿菌營養(yǎng)液添加劑的7H9培養(yǎng)液；③ 在最高檢測孔中再加入20 μL阿米卡星或左氧氟沙星存儲液，吹打混勻；④ 從最高檢測孔吸取100 μL含藥培養(yǎng)基至緊鄰培養(yǎng)孔中，吹打混勻，依次倍比稀釋至最低檢測孔，最后一孔作無藥對照孔；(3)藥物對細(xì)菌的MIC值：將100 μL細(xì)菌懸液加入制備好的含藥微孔板中，放置37℃培養(yǎng)箱中孵育，3 d后觀察結(jié)果。如孔板底部出現(xiàn)明顯沉淀為耐藥，底部無沉淀，培養(yǎng)基清亮則為敏感。(4)藥物儲存液濃度及倍比稀釋濃度范圍：根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的阿米卡星和左氧氟沙星對快速生長分枝桿菌臨界濃度，見表1，設(shè)定阿米卡星倍比稀釋范圍：0.125～32 μg/mL，左氧氟沙星倍比稀釋范圍：0.125～32 μg/mL。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 CLSI推薦阿米卡星和左氧氟沙星對快速生長分枝桿菌臨界濃度

1.6 含龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌組織切片制備 經(jīng)纖維支氣管鏡取得組織標(biāo)本，常規(guī)10%甲醛固定2～4 h、脫水過夜、石蠟包埋、4 μm厚連續(xù)切片、蘇木精 — 伊紅染色法染色。組織病理切片經(jīng)兩位主治醫(yī)師以上職稱的病理醫(yī)師閱片，簽發(fā)病理報(bào)告。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用EXCEL 2007收集數(shù)據(jù)，體外藥物殺菌活性采用50% MIC(MIC50)和90% MIC(MIC90)表示。

2 結(jié) 果

2.1 基因芯片檢測龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌結(jié)果 龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌和偶然分枝桿菌經(jīng)基因芯片鑒定的代表性圖片見圖1。

圖1 基因芯片檢測龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌和偶然分枝桿菌代表性圖片

注：A為龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌；B為偶然分枝桿菌。QC:表面化學(xué)質(zhì)控探針;EC：雜交陽性外對照探針；BC:空白對照；IC:內(nèi)對照探針；NC:陰性對照探針。

2.2 龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌鏡下特征 龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌抗酸染色呈陽性，菌體相對均一，散在分布，革蘭染色呈陽性，菌體相對均一，呈散在分布，菌體周圍及菌體中可見紫色小顆粒。偶然分枝桿菌抗酸染色呈陽性，菌體相對不規(guī)則，部分可見一端膨大凸起，革蘭染色呈陽性，菌體相對不規(guī)則，菌體周圍及菌體中可見紫色小顆粒。見圖2。

圖2 龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌和偶然分枝桿菌鏡下形態(tài)(10×100倍)

2.3 龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌組織病理形態(tài) 支氣管黏膜活檢鏡下顯示黏膜間質(zhì)有較多慢性炎細(xì)胞浸潤，纖維組織增生，不典型肉芽腫形成，未見明顯的壞死形成。

圖3 龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌和偶然分枝桿菌組織病理形態(tài)(10×10倍)

注：A：龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌組織病理形態(tài)；B：偶然分枝桿菌組織病理形態(tài)。

2.4 阿米卡星和左氧氟沙星對龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌的MIC值 阿米卡星對龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌的MIC50為2.0 μg/mL，MIC90為4.0 μg/mL，表現(xiàn)為敏感，左氧氟沙星對龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌的MIC50為16.0 μg/mL，MIC90為32.0 μg/mL，表現(xiàn)為耐藥，見表2。阿米卡星對偶然分枝桿菌的MIC50為0.5 μg/mL，MIC90為1.0 μg/mL，表現(xiàn)為敏感；左氧氟沙星對偶然分枝桿菌的MIC50為0.25 μg/mL，MIC90為1.0 μg/mL，1株表現(xiàn)耐藥，見表3。

表2 阿米卡星、左氧氟沙星對21株龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌藥物敏感性分布

表3 阿米卡星、左氧氟沙星對10株偶然分枝桿菌藥物敏感性分布

3 討 論

NTM感染可引起人體組織器官損害，已經(jīng)逐漸發(fā)展為一個(gè)公共衛(wèi)生問題，但其尚未列入法定傳染病范圍，未能引起相關(guān)部門的足夠重視。由于NTM和結(jié)核分枝桿菌的菌體成分和抗原有共同性，NTM引起的疾病的病理特征與結(jié)核病相似，較難鑒別。研究發(fā)現(xiàn)，NTM引起的疾病病理特征為干酪樣壞死較少，機(jī)體組織反應(yīng)較弱[9]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)水平的進(jìn)步，NTM臨床分離率也得到提高[10-11]。

本研究采用基因芯片鑒定出龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌和偶然分枝桿菌菌落，然后對其鏡下形態(tài)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌抗酸染色呈陽性，菌體相對均一，散在分布；革蘭染色呈陽性，菌體相對均一，呈散在分布，菌體周圍及菌體中可見紫色小顆粒。偶然分枝桿菌抗酸染色呈陽性，菌體相對不規(guī)則，可見一端膨大凸起；革蘭染色呈陽性，菌體相對不規(guī)則，菌體周圍及菌體中可見紫色小顆粒。同時(shí)，本研究中還發(fā)現(xiàn)，在羅氏培養(yǎng)基和血平板培養(yǎng)物中，兩種分枝桿菌菌體或周圍革蘭染色均伴有紫色顆粒存在，而抗酸染色并未發(fā)現(xiàn)有顆粒。這可能是兩種染色方法學(xué)上的差異所致，需要更多臨床樣本驗(yàn)證。

由于不同NTM對常規(guī)的抗結(jié)核藥物耐藥臨界點(diǎn)不同，NTM藥敏試驗(yàn)對臨床的用藥選擇尤為重要[1]。根據(jù)CLSI建議，對于快速生長分枝桿菌，常規(guī)藥敏試驗(yàn)應(yīng)包括阿米卡星和氟喹諾酮類藥物[12]。本研究中，龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌及偶然分枝桿菌均對阿米卡星敏感，對左氧氟沙星耐藥，與陳品儒等[13]研究結(jié)果相似，提示以阿米卡星為核心的治療方案用于治療快速生長型分枝桿菌感染患者可能是有效的，而氟喹諾酮類藥物(如左氧氟沙星)對快速生長型分枝桿菌感染患者的療效尚存爭議。

綜上所述，快速生長型分枝桿菌對阿米卡星高度敏感，準(zhǔn)確的菌種鑒定結(jié)果可為臨床選擇治療方案提供依據(jù)。