邱錦 黃火清 姚斌 羅會(huì)穎

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081）

淀粉是大量存在于自然界中的植物多糖［1]，是以葡萄糖為單體依次連接形成的高度聚合物。根據(jù)單糖連接方式不同，分為直鏈淀粉和支鏈淀粉［2-3]。淀粉除了可以被直接食用外，還是工業(yè)生產(chǎn)果葡糖漿、麥芽糖及釀酒等多種工業(yè)的主要原料［4]，其在被利用過程中必須被水解為低聚糖或單糖［5]。α-淀粉酶是一類作用于淀粉內(nèi)部水解其α-1，4糖苷鍵從而將淀粉水解為糊精、低聚糖和單糖的酶［6]。α-淀粉酶是工業(yè)上應(yīng)用最早、用途最廣及產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。可廣泛應(yīng)用于食品、動(dòng)物飼料、洗滌劑、生物燃料、生物制藥等多種工業(yè)生產(chǎn)過程中［8]。烘焙行業(yè)中，添加適量的淀粉酶可以增加面包的蓬松度，改善口感［9]；在啤酒釀造工業(yè)中，添加淀粉酶可以增加麥芽的降解率，提高利用率［10]；在洗滌劑行業(yè)中，淀粉酶可以有效降解淀粉類污漬［11]。α-淀粉酶可以從植物，動(dòng)物和微生物中獲得，同時(shí)淀粉酶的表達(dá)，純化，發(fā)酵等技術(shù)也日益成熟。其中，微生物來源的α-淀粉酶由于其穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)可行性而被普遍應(yīng)用［12]。

微生物來源的淀粉酶在生產(chǎn)應(yīng)用中變得愈加重要，與動(dòng)植物來源淀粉酶相比，真菌和細(xì)菌淀粉酶具有成本效益高、一致性好、生產(chǎn)所需時(shí)間和空間少、易于工藝修改和優(yōu)化等優(yōu)點(diǎn)［12]。尤其是芽孢桿菌來源的淀粉酶，已經(jīng)受到全世界研究人員的廣泛關(guān)注，并對(duì)其進(jìn)行了深入的研究。與其他微生物相比，芽孢桿菌是表達(dá)淀粉酶的優(yōu)勢(shì)菌株，表達(dá)量和酶活均相對(duì)較高。同時(shí)，由于芽孢桿菌自身的分泌表達(dá)系統(tǒng)，使得所產(chǎn)生的淀粉酶直接分泌到細(xì)胞外，無需細(xì)胞破碎等過程，酶學(xué)性質(zhì)檢測(cè)及純化步驟簡(jiǎn)單。目前，對(duì)芽孢桿菌來源的淀粉酶研究涉及熱穩(wěn)定性、水解活力及三維結(jié)構(gòu)等多個(gè)方面。其中，耐熱淀粉酶多來自于地衣芽孢桿菌［13]。此外，多個(gè)芽孢桿菌來源的淀粉酶晶體結(jié)構(gòu)也已經(jīng)被報(bào)道［14-16]。通過對(duì)結(jié)構(gòu)的研究得出，大多數(shù)芽孢桿菌來源的淀粉酶屬于糖苷水解酶13家族，同時(shí)具有Ca2+結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)對(duì)于這種來源淀粉酶也進(jìn)行了許多突變研究，酶學(xué)性質(zhì)顯著提高，并可以應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中。已有報(bào)道顯示通過定向進(jìn)化使淀粉酶在堿性條件下酶活提高5倍［17]，通過理性設(shè)計(jì)使解淀粉芽孢桿菌淀粉酶的最適溫度由83℃提高到106℃［18]。同時(shí)挖掘Ca2+非依賴型淀粉酶基因，以使在生產(chǎn)過程中降低成本［19]。

按照糖苷水解酶（Carbohydrate-active enzymes，CAZy））數(shù)據(jù)庫（http：//www.cazy.org/）的分類，α-淀粉酶主要屬于糖苷水解酶第13家族（GH13）［20]。另有少部分屬于GH57、GH119 或者 GH126家族［21-23]。目前已經(jīng)有多個(gè)GH13家族的淀粉酶結(jié)構(gòu)被報(bào)道［15-17]。GH13家族淀粉酶由 A（（β/α）8八桶狀結(jié)構(gòu)）、B、C（β-三明治結(jié)構(gòu)）3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。A結(jié)構(gòu)域是催化結(jié)構(gòu)域，天冬氨酸、谷氨酸及天冬氨酸構(gòu)成了催化活性中心。B結(jié)構(gòu)域的Loop區(qū)對(duì)淀粉酶的熱穩(wěn)定性起到重要作用［24]。C結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)β片層結(jié)構(gòu)，有報(bào)道指出它類似酶的底物結(jié)合域（Carbohydrate-binding module，CBM），對(duì)底物的結(jié)合起到重要作用［25]。因此對(duì)C結(jié)構(gòu)域進(jìn)行理性設(shè)計(jì)可能提高酶與底物的結(jié)合能力，從而提高水解活力。

具有高催化活力的淀粉酶由于其水解效率高，生產(chǎn)成本低，一直受到廣泛的青睞。目前已經(jīng)報(bào)道的淀粉酶生產(chǎn)菌株的產(chǎn)酶能力雖然能滿足工業(yè)生產(chǎn)需求，但仍有較大的提升空間。因此，如何利用生物技術(shù)手段，改造現(xiàn)有的淀粉酶，提高水解效率，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本依然是目前亟待解決的問題。本研究中，以目前廣泛應(yīng)用的來源于解淀粉芽孢桿菌的中溫中性淀粉酶BAMYA為出發(fā)蛋白，通過理性設(shè)計(jì)在該淀粉酶的C端結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)，利用定點(diǎn)突變得到了比活及催化效率均大幅度提高的突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K，并在枯草芽孢桿菌中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。該突變體應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)可有效提高其水解效率，降低應(yīng)用成本，有著非常廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 基因克隆宿主菌株大腸桿菌（Escherichia coli）Trans-T1、 感 受 態(tài) 細(xì) 胞 DMT購自北京全式金公司，表達(dá)宿主菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）SCK6及質(zhì)粒pHYP16由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 液體培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸提物5，胰蛋白胨 10，NaCl 10。LB 固體培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸提物 5，胰蛋白胨 10，NaCl 10，瓊脂粉 15。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸提物 20，蛋白胨 40，豆粕30，玉米粉 38，NaH2PO42。

1.1.3 試劑及儀器 直鏈淀粉購自 Sigma 公司；質(zhì)粒提取試劑盒及 DNA膠回收試劑盒購自 OMEGA 公司；FastPfu DNA聚合酶、快速突變?cè)噭┖校‵ast Mutagenesis System）、甲基化質(zhì)粒模板消化酶購自北京全式金公司，BeaverBead His-tag Protein Purification磁珠（組氨酸標(biāo)簽蛋白純化瓊脂糖磁珠）購自蘇州海貍生物科技有限公司，是專為高效、快速純化組氨酸標(biāo)簽蛋白而設(shè)計(jì)的一種新型功能化材料，可通過磁性分離方式直接從生物樣品中一步純化出高純度的目標(biāo)蛋白。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

T100 Thermal Cycler PCR與電轉(zhuǎn)儀、DYY-6C凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad），BioTek酶標(biāo)儀（美國Thermo），HiTrap Q XL陰離子柱（美國GE）。

1.2 方法

1.2.1 穿梭質(zhì)粒pHYP16-Amp-Bamy的構(gòu)建 本研究所用的質(zhì)粒，是在芽孢桿菌表達(dá)載體 pHYP16的基礎(chǔ)之上，利用同源重組的方法，加入大腸桿菌的復(fù)制原件以及氨芐抗性基因，得到穿梭型載體pHYP16-Amp，其能同時(shí)在大腸桿菌以及枯草芽孢桿菌中操作。來源于解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的淀粉酶基因Bamy是由公司合成，采用POE-PCR（Prolonged overlap extension PCR）［26]的方法，在載體上插入Bamy，得到pHYP16-Amp-Bamy。

POE-PCR程序如下：（1）擴(kuò)增目的基因Bamy：反 應(yīng) 體 系 50 μL ：10×buffer 5 μL，dNTP 5 μL，硫酸鎂 2 μL，pUC57-Bamy模板 1 μL，引物Bamy-F 1 μL，引物Bamy-R 1 μL，F(xiàn)astPfu DNA 聚合酶 1 μL，ddH2O 34 μL。PCR 條 件 為 ：95℃反應(yīng) 5 min，一個(gè)循環(huán)；95℃反應(yīng)30 s，60℃反應(yīng)30 s，72℃反應(yīng)1 min 30 s，以上3個(gè)步驟重復(fù)32個(gè)循環(huán)；72℃反應(yīng)10 min，一個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物取出后于4℃保存。（2）擴(kuò)增載體pHYP16：反應(yīng)體系50 μL：10×buffer 5 μL，dNTP 5 μL，硫酸鎂 2 μL，pHYP16 模板 1 μL，引物 pHYP16-F 1 μL，引物 pHYP16-R 1 μL，F(xiàn)astPfu DNA 聚 合 酶 1 μL，ddH2O 34 μL。PCR 條 件 為 ：95℃反應(yīng)5 min，一個(gè)循環(huán)；95℃反應(yīng)30 s，60℃反應(yīng)30 s，72℃反應(yīng)3 min 30 s，以上3個(gè)步驟重復(fù)32個(gè)循環(huán)；72℃反應(yīng)10 min，一個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物取出后于4℃保存。

將以上兩步得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，回收后進(jìn)行片段和載體搭建，體系如下：10× buffer 5 μL，dNTP 5 μL，硫酸鎂 2 μL，pHYP16 回收片段7 μL，Bamy回收片段3 μL。FastPfu DNA 聚合酶 1 μL，ddH2O 27 μL。PCR 條 件 為 ：95℃反應(yīng) 5 min，一個(gè)循環(huán)；95℃反應(yīng)30 s，60℃反應(yīng)30 s，72℃反應(yīng)5 min，以上3個(gè)步驟重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72℃反應(yīng)10 min，一個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物取出后于4℃保存。

PCR過程中所用引物序列，見表1。

表1 野生型質(zhì)粒及突變體構(gòu)建所用引物

將得到的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1，涂氨芐固體LB平板，37℃恒溫過夜培養(yǎng)，長出菌落后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，所用引物為Bamy-F/R。根據(jù)核酸電泳檢測(cè)結(jié)果，送條帶正確的克隆子進(jìn)行測(cè)序。得到穿梭型質(zhì)粒pHYP16-Amp-Bamy。

1.2.2 序列分析突變體設(shè)計(jì) 來源于嗜堿芽孢桿菌KSM-1378的高比活、中溫淀粉酶LAMY的比活比工業(yè)上廣泛應(yīng)用的、地衣芽孢桿菌來源的嗜熱淀粉酶的比活高10倍［27]。將淀粉酶BAMYA與LAMY進(jìn)行序列比對(duì)與結(jié)構(gòu)比對(duì)（圖1和圖2），尋找有差異的位點(diǎn)。同時(shí)由于針對(duì)的是水解活力方面的改造，我們將突變位點(diǎn)主要集中在與底物結(jié)合有關(guān)的C結(jié)構(gòu)域（C端），將有差異的位點(diǎn)進(jìn)行突變，設(shè)計(jì)突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K。

圖1 BAMYA與LAMY的序列比對(duì)結(jié)果

圖2 BAMYA（綠色）與LAMY（青色）三維結(jié)構(gòu)對(duì)比圖

1.2.3 載體pHYP16-BAMYA-L473K/K474H/N475K構(gòu)建 利用全式金快速突變?cè)噭┖校‵ast mutagenesis system）按照操作說明進(jìn)行突變。PCR體系為：2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix 25 μL，突變正向引物BamyA-F 1 μL，突變反向引物BamyA-R 1 μL，模板 pHYP16-Bamy質(zhì)粒 10 ng 1 μL，ddH2O 22 μL。PCR 條 件 為 ：94℃反應(yīng) 2 min，一個(gè)循環(huán) ；94℃反應(yīng)20 s，55℃反應(yīng)20 s，72℃反應(yīng)4 min，以上3個(gè)步驟重復(fù)25個(gè)循環(huán)；72℃反應(yīng)10 min，一個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物取出后于4℃保存。引物序列見表1。

PCR產(chǎn)物中加入1 μL DMT消化酶，在37℃水浴鍋中反應(yīng)1 h，取出后，10 μL產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌50 μL DMT感受態(tài)細(xì)胞中，菌液涂布于氨芐抗性平板，37℃過夜培養(yǎng)，待長出菌落后，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，目的基因?yàn)?.5 kb，經(jīng)核酸電泳檢測(cè)后，選擇條帶大小正確的轉(zhuǎn)化子測(cè)序。

1.2.4 重組酶BAMYA及突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K在芽孢桿菌中的表達(dá)及純化 將序列正確的野生型及突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌SCK6中，涂布于含有1.5% 可溶性淀粉的四環(huán)素抗性平板，于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。由于芽孢桿菌為分泌型表達(dá)宿主，成功表達(dá)的轉(zhuǎn)化子會(huì)在平板上顯示淀粉水解圈，在長出的轉(zhuǎn)化子中選擇菌體小、水解圈大的克隆，挑至50 mL LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min，過夜培養(yǎng)，即得到種子液。將種子液以4%接種量轉(zhuǎn)接至500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min，培養(yǎng)3 d。對(duì)所得到的發(fā)酵菌液離心后，收集上清，測(cè)定淀粉酶活力。

發(fā)酵上清濃縮10倍，濃縮用1 L去離子水清洗膜包，用1 L的0.5 mol/L NaOH清洗膜包中雜蛋白，最后用1 L去離子水清洗殘留的NaOH，然后對(duì)發(fā)酵上清進(jìn)行濃縮。在pH 7.4，20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中4℃過夜透析，透析后進(jìn)行磁珠親和層析。親和層析的純化步驟為：配置平衡 液 Binding buffer為 pH 7.4，20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，洗脫液為含有不同濃度咪唑（20 mmol/L、50 mmol/L、80 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、500 mmol/L） 的 pH 7.4，20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4。吸取海貍磁珠（是專為高效、快速純化組氨酸標(biāo)簽蛋白而設(shè)計(jì)的一種新型功能化材料，可通過磁性分離方式直接從生物樣品中一步純化出高純度的目標(biāo)蛋白）20 mL與磁力架上靜置30 s，棄掉廢液，依次用去離子水以及Binding buffer平衡磁珠，使其處于可以結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)的離子條件下。向平衡好的磁珠中加入50 mL上述透析好的淀粉酶液，漩渦混合2 h。取下后依次用含有20 mmol/L，50 mmol/L、80 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L及500 mmol/L的洗脫液進(jìn)行目的蛋白的洗脫，并收集所有洗脫液。進(jìn)行后續(xù)SDSPAGE蛋白電泳檢測(cè)。對(duì)含有目的蛋白的收集液，在pH 8.0，20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行過夜透析，透析后進(jìn)行陰離子柱純化，所用平衡緩沖液為pH 8.0，20 mmol/L Tris-HCl，洗脫液為在平衡液的基礎(chǔ)上加入1 mol/L NaCl。純化后進(jìn)行峰收集，測(cè)定酶活力，并利用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)。純化后得到的酶液用于酶學(xué)性質(zhì)分析。

1.2.5 α-淀粉酶的酶活測(cè)定 α-淀粉酶的酶活測(cè)定方法采用 DNS（3，5-二硝基水楊酸）定糖法［28]。將按 GB/T24401-2009 方法配制的 2% 可溶性淀粉用相應(yīng) pH 緩沖溶液稀釋至 1% 終濃度淀粉溶液作為底物，測(cè)量體系包括 900 μL的底物和 100 μL 適當(dāng)稀釋的酶液，在 55℃ 水浴鍋中反應(yīng) 20 min，加入 1.5 mL的 DNS 試劑終止反應(yīng)后，置于沸水浴中處理 5 min，快速冷卻至室溫后取250 μL混合液用酶標(biāo)儀讀取在波長540 nm下的吸光值，每組反應(yīng)設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照及3個(gè)平行（突變體的酶活力測(cè)定方法相同，溫度采用60℃）。

酶活單位（U）定義：在最適條件下，每分鐘水解可溶性淀粉生成 1 μmoL 葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位。

1.2.6 重組酶BAMYA及突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.2.6.1 最適pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定 純化后的野生型淀粉酶 BAMYA及突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K在最適溫度條件下（BAMYA為55℃，突變體為60℃），與不同 pH（pH 3.0-8.0，20 mmol/L 檸檬酸-磷酸鹽緩沖液）的底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，以測(cè)定其最適 pH。將 BAMYA及突變體在不同 pH 值（pH 3.0-8.0）的 20 mmol/L 檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中置于室溫下處理 1 h，再用 pH 6.0 的緩沖液作適當(dāng)稀釋，并在最適溫度、pH 6.0 的條件下測(cè)定剩余酶活，以未進(jìn)行處理的樣品酶活為 100% 對(duì)照，用于研究重組野生型BAMYA及突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K的pH 穩(wěn)定性。每個(gè)反應(yīng)3個(gè)平行及一個(gè)空白對(duì)照，根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制最適pH及pH穩(wěn)定性曲線。

1.2.6.2 最適溫度與溫度穩(wěn)定性的測(cè)定 用pH 6.0的緩沖液將純化后的BAMYA及突變體BAMYAL473K/K474H/N475K稀釋后，在不同溫度下（60-80℃）進(jìn)行酶促反應(yīng)以確定其最適溫度。將純化后的BAMYA及突變體分別在60、70和80℃ 下保溫，2 min、5 min、10 min、30 min及60 min取樣后迅速置于冰上5 min，并在最適溫度、pH 6.0 的條件下測(cè)定剩余酶活性，以未熱處理的酶活為 100% 對(duì)照，以研究野生型BAMYA及突變體的熱穩(wěn)定性。每個(gè)反應(yīng)3個(gè)平行及一個(gè)空白對(duì)照，根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制最適溫度及熱穩(wěn)定性曲線。

1.2.6.3 比活及動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 對(duì)所有需要測(cè)定酶學(xué)性質(zhì)的蛋白進(jìn)行定量，按照TransGene蛋白定量試劑盒的說明書進(jìn)行，如表2所示。將BSA按照表中所示濃度進(jìn)行配置后，吸取20 μL BSA標(biāo)準(zhǔn)品及待定量的樣品，與200 μL考馬斯亮藍(lán)顯色液混合，室溫放置10 min，在OD595nm下讀取吸光值，根據(jù)吸光值和蛋白濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合出蛋白含量與吸光度的線性關(guān)系。比活力單位定義為，每毫克酶蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。

分別配制最適 pH 下不同濃度的底物（0.5-10.0 mg/mL），酶反應(yīng)體系組成不變，但是酶反應(yīng)時(shí)間10 min。在最適條件下測(cè)定酶活力，利用 GraphPad Prism［29]軟件分析得到BAMYA及突變體以可溶性淀粉為底物時(shí)的Vmax和Km值。

表2 蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2 結(jié)果

2.1 穿梭質(zhì)粒pHYP16-Amp-Bamy的構(gòu)建

本研究所用基因是芽孢桿菌來源的，并且芽孢桿菌對(duì)于淀粉酶的表達(dá)量較高，因此我們選擇枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主。此外，本研究涉及大量的定點(diǎn)突變工作，相對(duì)于芽孢桿菌而言，大腸桿菌感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率高，因此，定點(diǎn)突變?cè)诖竽c桿菌中進(jìn)行，獲得突變后在芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒需要滿足可以同時(shí)在大腸桿菌以及芽孢桿菌中操作的條件。利用同源重組的方法，在芽孢桿菌表達(dá)載體pHYP16中插入了大腸桿菌復(fù)制原件以及氨芐抗性基因，得到穿梭型載體pHYP16-Amp。構(gòu)建好的質(zhì)粒及過成如圖3所示。

圖3 枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭型質(zhì)粒的構(gòu)建（A）插入淀粉酶基因Bamy、氨芐抗性基因及其啟動(dòng)子前（B）插入淀粉酶基因Bamy、氨芐抗性基因及其啟動(dòng)子后

2.2 序列分析和突變體的構(gòu)建

將突變位點(diǎn)集中在與底物結(jié)合有關(guān)的C結(jié)構(gòu)域，分析并突變后，對(duì)突變體基因進(jìn)行測(cè)序，得到組合突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K。

2.3 α-淀粉酶BAMYA及BAMYA-L473K/K474H/N475K在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)及純化

對(duì)突變后的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序后，利用Vector 10.0軟件進(jìn)行突變前后氨基酸及核酸序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果證明成功得到了突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pHYP16-BAMYA及其突變體在枯草芽孢桿菌SCK6中成功地實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，從含有可溶性淀粉的固體瓊脂平板中得到水解圈大的克隆子，進(jìn)行小瓶培養(yǎng)，而后轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。離心收集發(fā)酵液上清，測(cè)定淀粉酶活力約為760 U/mL和1 260 U/mL。將得到的粗酶液用 10 kD 膜包過濾濃縮以初步除去酶液中的鹽分及其他小分子物質(zhì)，進(jìn)一步用磁珠進(jìn)行純化及陰離子交換層析，進(jìn)行蛋白純化，經(jīng) SDS-PAGE 蛋白電泳檢測(cè)，得到電泳純酶蛋白（圖 4）。分子量約為55 kD，與理論計(jì)算分子量一致。

圖4 淀粉酶野生型以及突變體純化后SDS-PAGE分析

2.4 重組酶BAMYA及突變體酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

野生型淀粉酶BAMYA最適pH為6.0，最適溫度為55℃。突變體最適pH 6.0，最適溫度為60℃，與野生型相比最適溫度提高了5℃。BAMYA和突變體的pH穩(wěn)定性表現(xiàn)為：在pH 6.0均剩余40%左右酶活，pH 7.0-11.0穩(wěn)定，pH 12.0剩余50% 左右的酶活，在低于pH 5.0的條件下幾乎沒有酶活。BAMYA和突變體均具有很好的熱穩(wěn)定性，70℃處理30 min及80℃處理5 min，均剩余90% 以上的酶活。

2.5 比活及動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定

BAMYA的比活為6 835 U/mg，突變體BAMYAL473K/K474H/N475K比活為10 148 U/mg，比野生型提高48%；野生型的Km值為3.58 mg/mL，突變后BAMYA-L473K/K474H/N475K的Km值為2.21 mg/mL，突變后酶對(duì)底物的親和力提高；突變后催化效率由1 577 mL/（s·mg）提高至 4 760 mL/（s·mg），較野生型相比提高了2.01倍（圖 5）。

圖5 野生型BAMYA及突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K基本性質(zhì)

3 討論

中溫淀粉酶廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，其最適溫度大多在50-60℃［30]，提高中溫淀粉酶的水解活力及催化效率，以降低生產(chǎn)和使用成本，具有重要的意義。目前，關(guān)于淀粉酶水解活力的改造思路有很多，如Lu 等［31]對(duì)Bacillus pseudofirmus來源的淀粉酶通過N端截短，將其比活由4.9 U/mg提高到170 U/mg，Km由 11.9 mg/mL降 低 至 3.9 mg/mL；Yang等［32]通過將Alkalimonas amylolytica來源的堿性淀粉酶末端逐一截短并與寡肽融合表達(dá)，其比活由9.4 U/mg提高到239 U/mg，Km由26.9 mg/mL降低至15.4 mg/mL；Bessler 等［33]通過定向進(jìn)化得到解淀粉芽孢桿菌來源淀粉酶BAA水解活力明顯提高的突變體A230V/N297D/K406R/N414S，其比活由15 U/mg提高到140 U/mg。上述結(jié)果雖然酶活有一定的提高，但是仍然難以滿足工業(yè)生產(chǎn)要求。本研究利用定點(diǎn)突變，將來源于解淀粉芽孢桿菌，GH13家族的淀粉酶BAMYA進(jìn)行改良，所得到的淀粉酶突變體的比活達(dá)到了10 148 U/mg，并實(shí)現(xiàn)在枯草芽孢桿菌中的異源高效表達(dá)，突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K比活為10 148 U/mg，酶活力達(dá)到1 260 U/mL，可以用于實(shí)際生產(chǎn)中，大大降低成本。

本研究的突變位點(diǎn)位于近C末端C結(jié)構(gòu)域的473LKN475氨基酸，有文獻(xiàn)曾報(bào)道，C端氨基酸組成會(huì)影響淀粉酶的pH穩(wěn)定性［34]，但相同位置的突變對(duì)比活的影響并未報(bào)道過。GH13家族的淀粉酶C結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn) β 片層結(jié)構(gòu)，屬于一個(gè)未知的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Carbohydrate binding modules，CBM區(qū)）對(duì)于底物的識(shí)別和吸附有重要的作用［35]。因此對(duì)于該結(jié)構(gòu)域進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，可能增強(qiáng)其水解活力。還有報(bào)道稱，在淀粉酶中還有一些具有特殊功能的結(jié)構(gòu)域，大多數(shù)處于N端或者C端，在淀粉酶發(fā)揮水解活力的過程中起到重要作用。例如，來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）的普魯蘭酶［36]、嗜熱菌屬（Thermussp.）的麥芽淀粉酶［37]等在N端以外還含有類似的催化結(jié)構(gòu)域。另外一些淀粉酶在C結(jié)構(gòu)域之外還含有D、E結(jié)構(gòu)域，與C結(jié)構(gòu)域的功能類似，D結(jié)構(gòu)域使淀粉酶有水解生淀粉的能力，如已經(jīng)報(bào)道的曲霉（Aspergillus kawachii）α-淀粉酶［38]等，同時(shí)淀粉酶的C端結(jié)構(gòu)域的芳香族的氨基酸（組氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等）對(duì)底物結(jié)合起到重要的作用［35]，因此將K474H后，His的咪唑基團(tuán)更有利于結(jié)合糖鏈。另外，參與底物結(jié)合的氨基酸的空間構(gòu)象、以及氨基酸的結(jié)構(gòu)大小也影響著親和力［39]，在本研究中，將BAMYA（WP_013352208.1）的第473位非極性亮氨酸（L）突變?yōu)橘嚢彼幔↘）后，側(cè)鏈為底物提供了更好的結(jié)合取向。同時(shí)有研究表明，帶正電的氨基酸可降低Km，帶負(fù)電的氨基酸可提高Km［39]，N475K 突變后可能提高了酶對(duì)底物的親和力，從而提高了酶的比活和催化效率。本研究中，我們將BAMYA的C端進(jìn)行組合突變，突變位點(diǎn)L473K/K474H/N475K有效提高了BAMYA的催化活性，同時(shí)該研究為其它淀粉酶突變研究提供理論指導(dǎo)。

根據(jù)淀粉酶應(yīng)用的不同領(lǐng)域，對(duì)其性能的要求不盡相同。一些工業(yè)應(yīng)用中，不可避免有高溫過程，這就要求其酶活高的同時(shí)在高溫下具有較好的穩(wěn)定性。盡管有極為少數(shù)的解淀粉芽孢桿菌中溫淀粉酶穩(wěn)定性很好，盡管有少數(shù)的解中溫淀粉酶穩(wěn)定性很好，如一個(gè)Bacillussp. I-3來源的淀粉酶，其最適溫度70℃，在80℃下處理2.5 h后剩余50%酶活，但在最適條件下的表達(dá)量僅為642 U/mL［40]；一個(gè)Thermobifida fuscaNTU22來源的淀粉酶其最適溫度為60℃，60℃處理3 h仍剩余70%酶活，但比活僅為245 U/mg［41]；本研究中表達(dá)的淀粉酶BAMYA及其突變體在高溫下具有很好的穩(wěn)定性，同時(shí)水解活力及表達(dá)量均較高，突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K比活為10 148 U/mg，酶活力達(dá)到1 260 U/mL，為淀粉酶生產(chǎn)應(yīng)用提供了良好的材料。

綜上，本研究通過定點(diǎn)突變獲得一個(gè)高水解活力的α-淀粉酶基因，并在枯草芽孢桿菌中成功實(shí)現(xiàn)了高效異源表達(dá)。突變后得到了一個(gè)比活與催化效率明顯提高，同時(shí)熱穩(wěn)定性沒有明顯下降的淀粉酶突變體BAMYA-L473K/K474H/N475K。拓寬了淀粉酶在飼料、食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用，為生產(chǎn)應(yīng)用提供了優(yōu)良的材料。通過動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和氨基酸組成兩個(gè)角度分析了其比活提高的分子機(jī)制，加深了中溫淀粉酶在結(jié)構(gòu)與功能相互關(guān)系的認(rèn)識(shí)，也為淀粉酶的發(fā)展開辟了新的道路。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭型質(zhì)粒，通過理性設(shè)計(jì)對(duì)來源于解淀粉芽孢桿菌淀粉酶基因Bamy進(jìn)行定點(diǎn)突變。在保持其熱穩(wěn)定性沒有明顯下降的前提下，使其水解活力、催化效率均大幅度提高，比活相較于野生型提高48%。通過分析序列及結(jié)構(gòu)變化，對(duì)性質(zhì)提高的機(jī)理進(jìn)行了解釋，同時(shí)該項(xiàng)研究為淀粉酶的生產(chǎn)應(yīng)用提供了優(yōu)良材料。