朱 華，劉特立，王 風(fēng)，蔣金泉，韓雪迪，楊 志

(北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所 核醫(yī)學(xué)科 惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100142)

前列腺特異性膜抗原(prostate-specific membrane antigen, PSMA)高表達(dá)于前列腺癌及其轉(zhuǎn)移病灶中，其表達(dá)程度與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。PSMA作為前列腺癌診斷和治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)，已得到了業(yè)內(nèi)的關(guān)注，一系列靶向PSMA的小分子抑制劑已被用于前列腺癌的診斷和治療[1-4]。

基于前列腺癌組織代謝及特異靶點(diǎn)的PET分子影像可活體、無(wú)創(chuàng)顯示腫瘤細(xì)胞內(nèi)生化代謝異常和細(xì)胞特征靶點(diǎn)分子表達(dá)的變化，為腫瘤病灶探測(cè)、療效評(píng)估及腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的認(rèn)識(shí)提供技術(shù)手段。多種PET核素標(biāo)記的PSMA特異性化合物，如N-[N-[(S)-1,3-二羧基丙烷] 氨甲?；鵠-4-[18F]氟代芐基-L-半胱氨酸，N-[N-[(S)-1,3-Dicarboxypropyl]carbamoyl]-4-[18F]fluorobenzyl-L-cysteine(18F-DCFBC)，1-氨基-3-氟環(huán)丁烷-1-羧酸，anti-1-amino-3-18F- fluorocyclobutane-1-carboxylic acid(18F-DCFPyL)，N,N′-雙[2-羥基-5-(羧乙基)芐基]乙二胺-N,N′-二乙酸， N,N′-bis[2-hydroxy-5- (carboxyethyl)benzyl]ethylenediamine-N,N′-diacetic acid(68Ga-PSMA-HBED-CC)，(S)-2-(3-((S)-1-羧基-5-(3-(4-[123I]碘苯胺) 脲基)戊基)脲基)戊二酸，(S)-2-(3-((S)-1-carboxy-5-(3-(4-iodophenyl)ureido) pentyl)ureido)pentanedioic(99mTc-MIP-1095),68Ga-DKFZ-PSMA-617 已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床[5-9]。

64Cu(T1/2=12.7 h,β-:39%[Eβ-max=573 keV]，β+:17.4%[Eβ+max=656 keV])被國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)(IAEA)稱為“下一代PET核素”，64Cu核素的衰變過程中放出即利于診斷的射線又利于治療的粒子，有診療一體化的優(yōu)勢(shì)，具有廣闊的發(fā)展前景[10-11]。64Cu標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、成熟，標(biāo)記條件溫和，適用于多種小分子、多肽及單克隆抗體標(biāo)記。且其具有較長(zhǎng)的物理半衰期，適合在一定距離內(nèi)的藥物配送。本課題組借助于帶有固體靶系統(tǒng)的HM-20醫(yī)用加速器，已在國(guó)內(nèi)率先展開64Cu的生產(chǎn)和小分子、多肽及單抗的標(biāo)記與評(píng)價(jià)[12-16]。本研究中，考慮到DKFZ-PSMA-617中含有DOTA螯合劑，設(shè)計(jì)利用64Cu標(biāo)記DKFZ-PSMA-617的研究，擬為前列腺癌的診斷及治療提供理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要試劑

DKFZ-PSMA-617：ABX；乙醇：北京化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸、醋酸鈉：中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)有限公司；乙腈：Merck。所有試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

10、200、1 000 μL移液器：德國(guó)eppendorf；Sep-pak C-18柱：德國(guó)waters公司；高效液相色譜(HPLC)：1200系列，美國(guó)安捷倫公司；放射性薄層色譜掃描儀(Radio-TLC)：AR2000， 美國(guó)Bio-Scan公司；Hypersil BDS C-18反向色譜柱：5 μm，250.0 mm×4.6 mm，日本株式會(huì)社YMC；全自動(dòng)伽瑪計(jì)數(shù)儀：多探頭，美國(guó)Wizard2；放射性測(cè)量活度計(jì)：美國(guó)Capintec。64Cu2+由本實(shí)驗(yàn)室采用64Ni(p, n)64Cu 反應(yīng)自行生產(chǎn)，比活度大于5.6 GBq/μmol,體積濃度3.7 MBq/μL,生產(chǎn)情況詳見文獻(xiàn)[15]。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Balb/c裸鼠：20只，6周，雌性，北京華阜康生物科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)過程遵從北京腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作規(guī)范，倫理批準(zhǔn)號(hào)：2015KT08，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于北京腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房(許可證號(hào)：SCXK(京)2014-004)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 64Cu-PSMA-617制備

64Cu-PSMA-617放射性標(biāo)記示于圖1。取10 μL 2 g/L DKFZ-PSMA-617于一試管中，加入10～50 μL64Cu2+(3.7 MBq/μL)溶液，反應(yīng)體系為pH 5.5的0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液，于65 ℃孵育器中反應(yīng)10 min。結(jié)束后待體系溫度降至室溫，以2 mL注射器取出反應(yīng)產(chǎn)物，加至已活化的Sep-pak C18柱，用3 mL 純水沖洗，通過0.2 μm微孔濾膜，以1.0 mL 80%的乙醇溶液收集產(chǎn)物至無(wú)菌真空瓶中；使用N2將體系中乙醇吹干，之后向真空瓶中加入1.0 mL生理鹽水，測(cè)定放射性活度，待用。

2.2 64Cu-PSMA-617質(zhì)控

純化前后分別取2 μL產(chǎn)物滴至iTLC-SG試紙(試紙寬度為1 cm)下端1 cm處，置于展開體系(V甲醇∶V醋酸銨=1∶1)中，待產(chǎn)物展開至距下端10 cm處時(shí)取出晾干，進(jìn)行快速薄層掃描分析，并計(jì)算保留值(Rf)。

HPLC采用YMC-Pack ODS反向柱(5.0 μm，250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸的水溶液(A相)與體積分?jǐn)?shù)0.1%乙腈的三氟乙酸溶液(B相)，分析過程采用梯度流動(dòng)相，0 min至10 min B相由15%增加至60%，流速為1.0 mL/min，柱溫20 ℃，觀察放射性峰的保留時(shí)間。

2.3 體外穩(wěn)定性測(cè)試

取標(biāo)記產(chǎn)物64Cu-PSMA-617溶液適量，分別加至1.0 mL生理鹽水和5%人血清白蛋白兩溶液中，置于37 ℃孵育。分別于5、30、50、70 min和28 h后取出適量體積的生理鹽水體系中標(biāo)記產(chǎn)物，加入進(jìn)樣瓶中，調(diào)節(jié)進(jìn)樣量使放射性活度為 37～74 kBq，進(jìn)行Radio-HPLC分析，測(cè)定放化純度。

2.4 異常毒性實(shí)驗(yàn)

異常毒性實(shí)驗(yàn)為判斷是否有生產(chǎn)過程引入或其他原因所致的毒性。取小鼠5 只，體重18～22 g，每只小鼠分別靜脈注射0.5 mL放射性活度為1.85 MBq的64Cu-PSMA-617，且在4～5 s內(nèi)勻速注射完畢。48 h內(nèi)觀察小鼠存活情況。

2.5 生物分布及安全性測(cè)定

準(zhǔn)備16只正常昆明小鼠，隨機(jī)分為四組，分別進(jìn)行1、24、48 h生物分布研究。每只正常鼠均經(jīng)尾靜脈注射1.85 MBq64Cu-PSMA-617，在注射后對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行處理。眼球取血后斷頸處死小鼠，解剖獲得心臟、肝臟、脾臟、雙側(cè)腎臟、肌肉(股骨中斷附著處)、中上段股骨和大腦組織，對(duì)取得器官和組織進(jìn)行稱重，然后置于γ-counter管中進(jìn)行計(jì)數(shù)。取小鼠注射劑量的1%為標(biāo)準(zhǔn)樣，同時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)測(cè)定；數(shù)據(jù)通過excel和prism軟件計(jì)算和分析。

圖1 64Cu-PSMA-617的放射性標(biāo)記結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Scheme illustration of 64Cu-PSMA-617 radio-labeling

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)記與質(zhì)控

64Cu-PSMA-617標(biāo)記率在反應(yīng)溫度65 ℃，反應(yīng)時(shí)間10 min時(shí)即高于96.0%。標(biāo)記物64Cu-PSMA-617為無(wú)色透明溶液，pH在5.5～7.0之間。Radio-TLC顯示，64Cu-PSMA-617的Rf值約為0.6(圖2b)，無(wú)明顯膠體出現(xiàn)(膠體的Rf=0.0～0.1 )，無(wú)明顯64Cu殘留(64Cu的Rf=0.9～1.0 )(圖2a)。

由圖2c-d可知，64CuCl2的保留時(shí)間為4.0 min，目標(biāo)化合物64Cu-PSMA-617的保留時(shí)間為8.7min (其前體化合物DKFZ-PSMA-617保留時(shí)間為8.1 min)，放化純度大于97%，可不經(jīng)純化直接使用，適合進(jìn)一步的生物學(xué)評(píng)價(jià)。

圖2 64Cu-PSMA-617的 Radio-TLC(a、b)和Radio-HPLC分析(c)及非放射性DKFZ-PSMA-617的 HPLC 分析圖(d)Fig.2 Radio-TLC analysis of 64Cu-PSMA-617 (a, b) and Radio-HPLC analysis of 64Cu-PSMA-617 (c) and it’s precursor DKFZ-PSMA-617 (d)

3.2 穩(wěn)定性和毒性測(cè)試

將純化后的放射性探針置于不同緩沖體系中，取適量分別進(jìn)行HPLC分析，在8.3 min時(shí)出現(xiàn)標(biāo)記產(chǎn)物的放射性峰，而64Cu未見4～5 min之間的放射性峰。在生理鹽水和5%人血清白蛋白體系于37 ℃孵育兩個(gè)半衰期(T1/2=12.7 h)后，取樣品適量進(jìn)行Radio-HPLC測(cè)定，采用梯度流動(dòng)相分析，結(jié)果僅有少量64Cu解離，即64Cu-PSMA-617在生理鹽水體系及5%人血清白蛋白體系24 h后仍維持92%～94%的放化純度(圖3)，證實(shí)該體外環(huán)境下標(biāo)記產(chǎn)物具有較好的穩(wěn)定性。

實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)后均在正常飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，尾靜脈注射48 h內(nèi)持續(xù)觀察小鼠狀態(tài)，直至48 h觀察見所有小鼠均存活，未見異常，證實(shí)藥物并無(wú)異常毒性，即放射性核素淋洗及標(biāo)記產(chǎn)物制備過程中未污染外源性毒性物質(zhì)，放射性標(biāo)記產(chǎn)物64Cu-PSMA-617有望用于臨床轉(zhuǎn)化。

圖3 64Cu-PSMA-617在不同緩沖液條件下的體外穩(wěn)定性測(cè)試Fig.3 In-vitro stability test of 64Cu-PSMA-617 in each buffer

3.3 體內(nèi)分布情況

正常Balb/c小鼠經(jīng)尾靜脈注射64Cu-PSMA-617 1、24、48 h的各臟器生物分布示于圖4。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation)值。

圖4 64Cu-PSMA-617在正常Balb/c小鼠的體內(nèi)分布情況Fig.4 Bio-distribution studies of 64Cu-PSMA-617 in normal Balb/c mice

由圖4結(jié)果可見，隨時(shí)間的延長(zhǎng)在肝臟、腎臟、胃等器官中的放射性攝取逐漸降低。其中肝臟和腎臟有較高水平攝取，腎臟的放射性攝取主要由于分子探針的水溶性特征以及腎臟中高密度的PSMA非特異性受體表達(dá)。肝臟中較高水平的攝取與該分子探針的螯合基團(tuán)及肝臟中的多種代謝酶有關(guān)，該探針為DOTA螯合基團(tuán)，其對(duì)64Cu的偶聯(lián)易被肝臟中的一些氨基酸競(jìng)爭(zhēng)性解離，并滯留于肝臟。在腎臟部位，由于腎臟中有較高的PSMA表達(dá)，其富集不僅是由于代謝造成的，特異性的腎臟攝取也占據(jù)一部分。因此，通過新型試劑或者助劑的開發(fā)，降低腎臟攝取非常關(guān)鍵。此外，其余器官的攝取水平均較低，放射性本底水平較低利于腫瘤的觀察與顯像。

本項(xiàng)目，發(fā)揮本單位能夠生產(chǎn)高比活度的64Cu的優(yōu)勢(shì)，考慮到DKFZ-PSMA-617中含有DOTA螯合劑的實(shí)際情況，設(shè)計(jì)出利用64Cu標(biāo)記DKFZ-PSMA-617的研究，而且64Cu核素的衰變過程中即放出利于診斷的射線，又有利于治療的粒子，有診療一體化的優(yōu)勢(shì)，因此本研究對(duì)64Cu標(biāo)記DKFZ-PSMA-617進(jìn)行前期研究從而為過渡到治療提供更多理論依據(jù)。

4 小結(jié)

利用固體靶系統(tǒng)制備的64Cu標(biāo)記PSMA-617，標(biāo)記條件pH 5.5和反應(yīng)溫度65 ℃可實(shí)現(xiàn)95%以上的標(biāo)記率，經(jīng)Radio-TLC/HPLC測(cè)定放化純度較高。標(biāo)記化合物在多種緩沖液中放置24 h依然保持原有純度。經(jīng)過尾部靜脈注射到小鼠體內(nèi)后，放射性主要積累在肝臟/腎臟部位，符合該探針在生物體內(nèi)的代謝行為。探針得益于64Cu核素較長(zhǎng)的物理半衰期，64Cu-PSMA-617有助于顯示腫瘤更多新陳代謝的病理生理學(xué)特性，有望為前列腺癌和其他PSMA陽(yáng)性實(shí)體瘤的治療提供更多前期依據(jù)。