李偉哲，劉 露，張 輝，肖 勤

( 1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066003 )

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)[1]。1985年，美國(guó)學(xué)者M(jìn)ulis等首創(chuàng)了PCR技術(shù)，并由美國(guó)PE-Cetus公司進(jìn)一步開發(fā)研制[2]。PCR技術(shù)的最大特點(diǎn)為可將微量的基因片段短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，并具有較高的靈敏度和特異性，可對(duì)目的基因進(jìn)行快速檢測(cè)，因此，其應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。目前，PCR技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)[3]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[4]、轉(zhuǎn)基因食品[5]、水產(chǎn)養(yǎng)殖[6]等多個(gè)領(lǐng)域。隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，以常規(guī)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，根據(jù)需求不同，又衍生出多種新型PCR技術(shù)，如多重PCR[7]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR[8]、巢式PCR等[9]。這些技術(shù)在病原菌快速檢測(cè)方面，特別是在多種病原菌的同時(shí)檢測(cè)、分型鑒定，以及定量檢測(cè)方面均優(yōu)于其他技術(shù)。各類PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物臨床疾病診斷，為其在水產(chǎn)動(dòng)物疾病檢測(cè)中的應(yīng)用提供了相應(yīng)的技術(shù)基礎(chǔ)。

隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模持續(xù)擴(kuò)大[10]，集約化程度不斷提高，我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害頻繁暴發(fā)，其致病微生物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已達(dá)200種以上[11]。常規(guī)的水產(chǎn)動(dòng)物疾病檢測(cè)手段在其靈敏度方面還有欠缺，難以用于對(duì)微量致病微生物的快速檢測(cè)。近年來，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)PCR技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物致病微生物檢測(cè)及實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究[12]。筆者基于此，對(duì)各類PCR技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，并對(duì)新型PCR技術(shù)在該方面的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

1 常規(guī)PCR

常規(guī)PCR是根據(jù)目的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其特異性片段，并進(jìn)行電泳分析[13]。目前，PCR技術(shù)已應(yīng)用于多種細(xì)菌的診斷及樣品檢測(cè)。2001年Altinok等[14]以魯氏耶爾森氏菌(Yersiniaruckeri)的16S rRNA保守序列設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用PCR技術(shù)，在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)血樣中成功檢測(cè)出了該細(xì)菌，實(shí)現(xiàn)了對(duì)鮭科魚類紅嘴病的快速檢測(cè)。2009年，文萬僥等[15]建立了基于PCR技術(shù)的河流弧菌(Vibrioftuvialis)快速檢測(cè)體系，特異性良好，其靈敏度可達(dá)9.3×103cfu/mL。隨后，姚東瑞等[16]建立了一種哈維氏弧菌(V.harveyi)的PCR檢測(cè)體系，該體系可用于快速診斷由此細(xì)菌所引起的水產(chǎn)動(dòng)物疾病。蔣依依等[17]根據(jù)諾卡氏菌(Nocardiaseriolae)的16S～23S轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Intergenic spacers, ITS)序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了諾卡氏菌的PCR快速檢測(cè)體系，具有較好的特異性。同時(shí)該 PCR 體系也具有較高的靈敏度，對(duì) DNA 模板的檢出限可達(dá)5 pg/μL，該方法比傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定更為靈敏、高效。黃冠軍等[18]基于柱狀黃桿菌(Flabobacteriumcolumnare)保守性毒力基因即硫酸軟骨素裂解酶基因的一段保守序列，建立了柱狀黃桿菌的常規(guī)PCR檢測(cè)體系，具有較好的檢測(cè)特異性，對(duì)靶標(biāo) DNA的檢測(cè)靈敏度為pg級(jí)，對(duì)柱狀黃桿菌的檢測(cè)靈敏度為1.25×103cfu/mL。

除細(xì)菌外，PCR技術(shù)對(duì)病毒的檢測(cè)也在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治中得到了應(yīng)用。例如孫新穎等[19]將不同地區(qū)得到的白斑綜合征病毒核酸樣本通過設(shè)計(jì)特定引物，對(duì)ORF14/15、ORF23/24、ORF75、ORF94以及ORF125片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過測(cè)序來分析不同樣本的缺失及變異差異。結(jié)果顯示，白斑綜合征病毒在中國(guó)不同地區(qū)存在一定程度的變異, 其在序列中的缺失、重復(fù)單元數(shù)目以及單核苷酸多態(tài)性的差異較為明顯。隨后Simrouni等[20]利用PCR技術(shù)對(duì)不同地區(qū)的白斑綜合征病毒的ORF94序列進(jìn)行了分析對(duì)比，證實(shí)在8個(gè)不同國(guó)家白斑綜合征病毒的該片段都存在一定程度的變異，且白斑綜合征病毒的變異存在不同來源，主要為飼料和仔蝦。把握好這兩點(diǎn)因素可避免對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。常規(guī)的PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)單，可特異性的快速檢測(cè)細(xì)菌和病毒，但為滿足多層次、快速、精準(zhǔn)的檢測(cè)需求，又衍生出多種新型PCR技術(shù)[21]。

2 多重PCR

多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系中，加入多對(duì)不同特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)目的基因片段的PCR技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是可同時(shí)對(duì)多種病原微生物進(jìn)行檢測(cè)或鑒定。

在病毒檢測(cè)方面，Tsai等[26]建立了可同時(shí)檢測(cè)白斑綜合征病毒和桃拉綜合征病毒的多重PCR檢測(cè)體系。以3個(gè)引物組，按3∶1∶1的比例混合擴(kuò)增桃拉綜合征病毒，白斑綜合征病毒和凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)基因組。結(jié)果表明，在沒有病毒感染的情況下，僅有一條片段進(jìn)行了擴(kuò)增；在被白斑綜合征病毒或桃拉綜合征病毒感染的樣本中，出現(xiàn)了兩條擴(kuò)增片段；在同時(shí)感染兩種病毒的情況下，所有3種擴(kuò)增片段可同時(shí)被檢測(cè)到，該結(jié)果對(duì)白斑綜合征病毒和桃拉綜合征病毒的同時(shí)檢測(cè)有一定指導(dǎo)意義。2014年劉飛等[27]針對(duì)6種對(duì)蝦病毒，包括白斑綜合征病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒、肝胰腺細(xì)小病毒、桃拉綜合征病毒、對(duì)蝦桿狀病毒和傳染性肌肉壞死病毒分別設(shè)計(jì)引物，成功進(jìn)行了多重PCR檢測(cè)。

在病毒的分型檢測(cè)方面，多重PCR是首選技術(shù)之一。曾偉偉等[28]針對(duì)草魚呼腸孤病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型毒株的保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)3對(duì)引物，建立了草魚呼腸孤病毒三重反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)體系。該方法對(duì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型草魚呼腸孤病毒的檢測(cè)限分別為260、190、230 拷貝的病毒量。該方法可特異性的檢測(cè)各種類型的草魚呼腸孤病毒, 且具有較高的敏感性。

以上研究充分證明，多重PCR技術(shù)具有較常規(guī)PCR省時(shí)、簡(jiǎn)便且試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際檢測(cè)中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。但在檢測(cè)過程中也存在著不足，若有極少量外源性DNA污染，就可能會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另外，多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增時(shí)，若試驗(yàn)條件控制不當(dāng)，很容易導(dǎo)致進(jìn)行非特異性擴(kuò)增。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR (FQ-PCR)是通過監(jiān)測(cè)PCR 反應(yīng)過程中所加入熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)，利用已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)未知樣品進(jìn)行定量分析的一種核酸定量技術(shù)。近幾年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)受到了廣泛關(guān)注[29-31]。該方法可實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR過程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析，很好的解決了PCR只能定性而不能定量的問題。實(shí)時(shí)熒光定量PCR包括探針型和非探針型兩類。

探針型是在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)的一段，并與靶序列形成互補(bǔ)的寡核苷酸序列，通過探針的熒光強(qiáng)度指示擴(kuò)增量，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物同步。實(shí)時(shí)熒光定量PCR工作原理見圖1[29]。隨著各種新探針技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，韋信賢等[32]總結(jié)了目前常用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR探針(表1)。

圖1 TaqMan熒光探針工作原理[29]

非探針型則通常利用染料來指示擴(kuò)增量，特異性較探針型稍低，但試驗(yàn)操作簡(jiǎn)潔方便。非探針型工作原理見圖2[29]，雙鏈嵌合熒光染色Ⅰ可以結(jié)合到雙鏈DNA上面，隨著PCR過程的進(jìn)行，結(jié)合的雙鏈嵌合熒光染色Ⅰ染料分子逐漸增多，所檢測(cè)到的熒光信號(hào)亦相應(yīng)增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。

圖2 雙鏈嵌合熒光染色Ⅰ工作原理[29]

表1 目前熒光定量PCR常用探針比較[32]

注：“+”代表程度的強(qiáng)弱或難易.

目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)已成功應(yīng)用于水產(chǎn)病毒的檢測(cè)。Liu等[33]建立了傳染性肌肉壞死病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，該方法可檢測(cè)到傳染性肌肉壞死病毒質(zhì)粒cDNA可低至1拷貝/μL，且不與其他病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)，具有很好的靈敏度和特異性。Liu等[34]根據(jù)蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei)的SSU rDNA序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，建立了蝦肝腸胞蟲的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，其靈敏度可達(dá)8.3×101拷貝/μL，較傳統(tǒng)PCR方法，該法還有可快速檢測(cè)大批量樣本的優(yōu)點(diǎn)。Kumar等[35]建立了一種檢測(cè)靈敏度低至12 拷貝/μL的斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，該體系可以有效地用于斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒的定量檢測(cè)，且與傳染性皮下及造血組織壞死病毒、白斑綜合征病毒和肝胰腺細(xì)小病毒無交叉反應(yīng)。該方法還可通過對(duì)蝦排泄物的檢測(cè)來判斷親體中低水平的斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒感染狀況，可見其靈敏度之高。劉寶彬等[36]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)天津大港地區(qū)采集的108尾凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，傳染性皮下及造血組織壞死病毒陽性檢出率100%，每微克對(duì)蝦組織DNA 的病毒拷貝數(shù)為103～107；蝦肝腸胞蟲陽性檢出率為49.1%，每微克對(duì)蝦組織DNA的拷貝數(shù)為103～105。最終通過對(duì)病毒載量指數(shù)相關(guān)性分析證實(shí)，該批蝦患病為傳染性皮下及造血組織壞死病毒和蝦肝腸胞蟲的混合感染所致，充分體現(xiàn)了該方法可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并對(duì)大量樣品準(zhǔn)確定量的優(yōu)點(diǎn)。

在實(shí)時(shí)熒光定量PCR與其他檢測(cè)方法的對(duì)比中，Poulos等[37]利用原位雜交、免疫組織化學(xué)、常規(guī)反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 4種方法檢測(cè)桃拉綜合征病毒時(shí)指出，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是檢測(cè)桃拉綜合征病毒晚期慢性感染疾病的最佳選擇。Pooljun等[38]建立了一種檢測(cè)蝦偷死野田村病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系。結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)靈敏度可達(dá)1 拷貝/μL，而常規(guī)PCR與巢式PCR最低檢測(cè)限分別為10 000拷貝/μL和100拷貝/μL，與常規(guī)PCR及巢式 PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度顯然更高。Jin等[39]對(duì)平板計(jì)數(shù)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR兩種定量檢測(cè)方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)蝦副溶血弧菌的靈敏度約為58 cfu/mL，與標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)方法相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量結(jié)果顯示出良好的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(r2=0.96)。付小哲等[40]針對(duì)傳染性脾腎壞死病毒的開放讀碼框ORF007基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系。結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定的病毒拷貝數(shù)與細(xì)胞病變效應(yīng)法測(cè)定的病毒滴度具有良好的線性關(guān)系，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法可替代細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)法應(yīng)用于定量測(cè)定傳染性脾腎壞死病毒疫苗抗原含量，大大縮短了疫苗制備的時(shí)間。這些充分說明了該法的優(yōu)越性。目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性良好、靈敏度較高、速度快，但試驗(yàn)成本較高，需要特殊的熱循環(huán)儀和試劑，操作過程較為復(fù)雜，從而限制了其廣泛的應(yīng)用。

4 巢式PCR

巢式PCR(Nested PCR)是同時(shí)使用兩對(duì)PCR引物擴(kuò)增目的片段，第一對(duì)引物和普通PCR相似，第二對(duì)引物位于第一次PCR擴(kuò)增片段的內(nèi)部。其優(yōu)點(diǎn)在于第二輪PCR產(chǎn)物幾乎或完全沒有因引物特異性弱而造成非特異性擴(kuò)增，特異性非常高。

目前，巢式 PCR也已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物疾病的檢測(cè)，李晨等[41]以急性病毒性壞死病毒全基因組序列中的保守區(qū)段設(shè)計(jì)引物，建立了巢式 PCR檢測(cè)體系，成功檢測(cè)出櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)中的急性病毒性壞死病毒。高文輝等[42]在牡蠣皰疹病毒3個(gè)變異株全基因組序列比對(duì)的基礎(chǔ)上，篩選出牡蠣皰疹病毒基因組中高度保守的DNA聚合酶基因片段，建立了巢式PCR檢測(cè)體系。結(jié)果表明，該方法能穩(wěn)定地檢出100 拷貝/μL的病毒DNA，且不與其他海水養(yǎng)殖動(dòng)物常見的病原發(fā)生交叉反應(yīng)，具有較高特異性，適用于牡蠣皰疹病毒不同變異株的檢測(cè)。王紫燕等[43]分別以巢式 PCR和常規(guī)PCR來檢測(cè)白紋伊蚊(Aedesalbopictus)幼蟲體內(nèi)的白斑綜合征病毒，結(jié)果表明，相比于常規(guī)PCR，巢式 PCR的靈敏度與擴(kuò)增效率更高。另外，Kim等[44]依據(jù)pGEM-T載體中的氨芐西林抗性基因設(shè)計(jì)引物，建立了鯉春病毒的巢式 PCR檢測(cè)體系。結(jié)果表明，與常規(guī)PCR相比，巢式 PCR可降低假陽性現(xiàn)象，提高鯉春病毒檢測(cè)準(zhǔn)確性，但在實(shí)際應(yīng)用中該技術(shù)仍存在重復(fù)性較差、條件要求較高等不足之處。

5 反轉(zhuǎn)錄PCR

反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)又稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR，其原理是以RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，再對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，從而檢測(cè)目的基因。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，存在大量由RNA病毒感染的疾病。張奇亞[45]總結(jié)了水產(chǎn)動(dòng)物病毒中RNA病毒的種類(表2)。

表2 水生動(dòng)物RNA病毒屬及形態(tài)結(jié)構(gòu)特征[45]

注：“+”代表有囊膜，“-”代表無囊膜.

反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)是檢測(cè)RNA病毒的主要方法。Xie等[46]建立了多重反轉(zhuǎn)錄PCR體系，同時(shí)從蝦中檢測(cè)出桃拉綜合征病毒、白斑綜合征病毒和傳染性皮下及造血組織壞死病毒3種病毒。說明該方法同樣適用于多種RNA病毒的同時(shí)檢測(cè)。2014年Yuasa等[47]成功檢測(cè)出位于復(fù)制階段的錦鯉皰疹病毒。隨后Shimahara等[48]以鯉春病毒的G蛋白基因設(shè)計(jì)引物，建立了反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)體系。其檢測(cè)極限為7.1×102拷貝/μL，且該方法不僅適用于檢測(cè)病毒懸浮液中所提取的RNA，同樣可鑒別存在于魚組織中的RNA。2018年Hwang等[49]基于病毒性出血性敗血癥病毒核衣殼基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了病毒性出血性敗血病病毒4種基因型的反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)體系。并應(yīng)用于來自韓國(guó)褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)的病毒性出血性敗血病病毒的鑒定。另外，基于反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，Kim等[50]設(shè)計(jì)了5對(duì)針對(duì)病毒性出血性敗血病病毒核蛋白(N)基因的引物，建立了一種新型循環(huán)反轉(zhuǎn)錄PCR(cRT-PCR)體系，其靈敏度優(yōu)于細(xì)胞培養(yǎng)法、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法的檢測(cè)。以上說明RT-PCR技術(shù)已開始廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物RNA病毒的檢測(cè)中。

但在實(shí)際應(yīng)用中RNA容易降解，易導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。此外，RNA提取過程以及反轉(zhuǎn)錄過程中也容易導(dǎo)致假陰性的結(jié)果出現(xiàn)。針對(duì)這一問題，Kiatpathomchai等[51]以黃頭病毒的開放閱讀框架3序列(編碼gp64蛋白)設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，以蝦的血淋巴為樣本，溶于10%的檸檬酸鈉混合進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)，有效減少了因RNA降解所產(chǎn)生的影響。

6 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR(dPCR)也稱單分子PCR，是近年來核酸定量的新方法，其中微滴數(shù)字PCR(ddPCR)最為常見。其檢測(cè)過程主要包括PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)分析兩部分(圖3)[52]。在PCR反應(yīng)前，將樣品分散至幾萬個(gè)單元反應(yīng)室中，使每個(gè)單元中只存在單個(gè)DNA分子。在熒光信號(hào)分析階段，采用終端檢測(cè)，對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行采集，然后計(jì)數(shù)得到樣品的原始濃度。與實(shí)時(shí)熒光定量PCR不同的是，整個(gè)數(shù)字PCR過程不需要設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，且具有更高的特異性和重現(xiàn)性，可以實(shí)現(xiàn)真正意義上的絕對(duì)定量。

圖3 數(shù)字PCR原理[52]

Jia等[53]比較了反轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR(RT-ddPCR)與逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(RT-qPCR)兩種方法對(duì)13個(gè)不同區(qū)域的傳染性造血器官壞死病毒毒株的測(cè)定。結(jié)果表明，反轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR雖然檢測(cè)靈敏度與檢測(cè)范圍弱于反轉(zhuǎn)錄定量PCR，但其相關(guān)性可達(dá)到69.4%～100%。郝中香等[54]以O(shè)RF6基因設(shè)計(jì)鯉皰疹病毒Ⅱ型引物，建立了數(shù)字PCR檢測(cè)體系。結(jié)果顯示，數(shù)字PCR的檢測(cè)靈敏度較熒光定量PCR高5倍，且重復(fù)性較高，適合于鯉皰疹病毒Ⅱ型的快速檢測(cè)和病原流行病學(xué)調(diào)查。趙欣等[55]對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型的進(jìn)一步研究顯示，數(shù)字PCR及熒光定量PCR兩種方法線性關(guān)系和特異性均良好。但與熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR具有更高的重復(fù)性，且在臨床樣品檢測(cè)中，數(shù)字PCR技術(shù)的陽性檢出率為76.67%，熒光定量PCR技術(shù)的陽性檢出率為73.33%，表明數(shù)字PCR技術(shù)在鯉皰疹病毒Ⅱ型實(shí)際檢測(cè)中具有一定的優(yōu)勢(shì)。

這些試驗(yàn)數(shù)據(jù)充分證明數(shù)字PCR能實(shí)現(xiàn)靈敏、準(zhǔn)確的絕對(duì)定量，且數(shù)字PCR能夠有效避免常規(guī)PCR抑制劑苯酚、氯化鈉、鐵離子等的影響[56]。但其耗材成本高、試驗(yàn)通量少，不能實(shí)現(xiàn)操作智能化，儀器定價(jià)高，成為該技術(shù)推廣使用的一大難題。

7 PCR與其他技術(shù)的聯(lián)用

PCR不僅可以單獨(dú)用來檢測(cè)病原體, 也可與其他技術(shù)相結(jié)合從而充分發(fā)揮其優(yōu)點(diǎn)。Di等[57]將PCR與ELISA聯(lián)用對(duì)貝類中副溶血弧菌進(jìn)行了檢測(cè)。其主要利用ELISA方法代替電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與電泳相比，PCR-ELISA的檢測(cè)靈敏度提高了100倍。張蕾等[58]將PCR與納米免疫磁分離技術(shù)(Nano-IMB)結(jié)合，建立了一種針對(duì)副溶血弧菌的反轉(zhuǎn)錄PCR快速檢測(cè)方法。納米免疫磁珠在菌體濃度為103cfu/mL時(shí)，對(duì)副溶血弧菌的捕獲率達(dá)到74%，將納米免疫磁珠與反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)相結(jié)合，檢測(cè)副溶血弧菌的靈敏度可達(dá)140 cfu/mL，在食品基質(zhì)添加試驗(yàn)中，其檢測(cè)限為2 cfu/25 g樣品，該技術(shù)具有很好的應(yīng)用價(jià)值和應(yīng)用前景。尹偉力等[59]建立了一種可同時(shí)檢測(cè)桃拉綜合征病毒、黃頭病毒的液相芯片技術(shù)。該方法以桃拉綜合征病毒的衣殼蛋白CP2基因和黃頭病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白N基因設(shè)計(jì)特異性引物并標(biāo)記生物素，探針氨基化修飾，熒光編碼微球偶聯(lián)后與桃拉綜合征病毒、黃頭病毒反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物雜交，并用液相芯片儀器檢測(cè)熒光信號(hào)。該方法最低檢測(cè)限可達(dá)100 pg/μL，與白斑綜合征病毒、鯉春病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒等均無交叉反應(yīng)，與常規(guī)PCR 技術(shù)相比，由于液相芯片檢測(cè)體系通過激光檢測(cè)核酸雜交微球的集合體，有效避免了多種核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的相互干擾，提高了靈敏度。另外Xu等[60]建立了多重PCR與高效液相色譜(HPLC)聯(lián)合快速檢測(cè)方法(mPCR-HPLC)，可同時(shí)檢測(cè)副溶血弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)等。該方法特異性良好，靈敏度可達(dá)10 cfu/mL，可用于定量監(jiān)測(cè)樣本中目標(biāo)菌的動(dòng)態(tài)變化。

各種技術(shù)的聯(lián)用，通過充分發(fā)揮其各自優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了提高靈敏度、特異性及檢測(cè)通量的目的，形成了常規(guī)方法無法比擬的優(yōu)勢(shì)。但是在實(shí)際應(yīng)用上還略顯不足，因此PCR技術(shù)與其他技術(shù)的創(chuàng)新聯(lián)用還需進(jìn)一步的開拓與發(fā)展。

8 結(jié)論與展望

PCR技術(shù)目前在水產(chǎn)動(dòng)物疾病檢測(cè)方面，已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，很多新型的衍生技術(shù)如多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、巢式PCR等也有初步應(yīng)用。另外，PCR與其他技術(shù)如酶聯(lián)免疫吸附、納米磁性微球免疫分離、高效液相色譜等的聯(lián)用，也得到了進(jìn)一步的發(fā)展。在實(shí)際臨床樣品檢測(cè)中，應(yīng)針對(duì)不同檢測(cè)方法的特點(diǎn)進(jìn)行合理選擇，在應(yīng)用中不斷積累經(jīng)驗(yàn)，優(yōu)化各種方法，才能使PCR技術(shù)在水產(chǎn)疾病檢測(cè)領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用。隨著PCR相關(guān)技術(shù)的發(fā)展及其與其他技術(shù)的聯(lián)用，在未來的水產(chǎn)動(dòng)物疾病檢測(cè)領(lǐng)域，PCR技術(shù)將向著易操作、低成本、高靈敏度、高特異性及自動(dòng)化的趨勢(shì)發(fā)展，并將以其特有的優(yōu)勢(shì)在水產(chǎn)動(dòng)物疾病診斷中發(fā)揮更大的作用，推動(dòng)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。