彭小媚,陳 棟，陳善昌，林永恩

(廣西壯族自治區(qū)賀州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西賀州 542800)

宮頸癌是婦女常見的惡性腫瘤之一,是世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題[1]，嚴(yán)重危害婦女的生命健康。在世界范圍內(nèi),宮頸癌是女性的第四大惡性腫瘤,約占影響女性的所有類型惡性腫瘤的12%[2]，全球每年新增宮頸癌人數(shù)已超50萬(wàn)，死亡人數(shù)亦超20萬(wàn)[3]，且發(fā)病年齡日益年輕化，是威脅婦女生命健康的重要因素之一。根據(jù)我國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,2015年子宮頸癌新發(fā)病例數(shù)約為9.89萬(wàn)例,死亡人數(shù)約300萬(wàn)例[4]。人乳頭瘤病毒(HPV)是一種嗜上皮性病毒，在人和動(dòng)物中分布廣泛，有高度的特異性，持續(xù)感染是女性宮頸病變的主要原因。HPV感染引起的癌癥，主要是黏膜和皮膚的鱗狀細(xì)胞癌(SCC)[5]。HPV是誘導(dǎo)宮頸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┣安∽兓虬┌Y的最重要因素，HPV感染狀態(tài)是宮頸癌篩查中的關(guān)鍵因素。因此，HPV檢測(cè)已成為一種重要的篩查工具[6]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致人類感染的HPV有100多種型別，而不同型別的感染與宮頸疾病的發(fā)生不盡相同，根據(jù)與宮頸癌發(fā)生的相關(guān)性進(jìn)行分析，國(guó)際腫瘤研究所根據(jù)其致癌性與否將HPV亞型分為高危型和低危型兩類[7]。大量研究已證實(shí)，高危型HPV的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的重要因素[8-9]，99%的宮頸癌患者檢測(cè)出HPV高危亞型感染。有效的醫(yī)學(xué)干預(yù)能夠降低宮頸癌的發(fā)病率，及早發(fā)現(xiàn)HPV感染分型對(duì)提前進(jìn)行防治有重要的臨床意義。研究表明HPV亞型分布與地區(qū)、環(huán)境、人群等因素相關(guān)[10]，為了解賀州地區(qū)HPV基因分型及流行分布情況，本研究采用基因芯片技術(shù)對(duì)本院就診的16 751例婦女的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行基因分型檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年1月至2018年9月本院婦科就診及體檢健康者，年齡10～92歲，平均(38.5±10.6)歲，自愿接受生殖道HPV感染篩查的女性宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本為16 751例，已剔除復(fù)診病例。

1.2儀器與試劑 PCR擴(kuò)增儀黑馬9600購(gòu)自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器公司，分子雜交儀Combi_H12購(gòu)自深圳亞能公司，熱循環(huán)儀K960購(gòu)自杭州晶格科學(xué)儀器有限公司。HPV基因分型檢測(cè)試劑盒為深圳亞能生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。該試劑醫(yī)療器械注冊(cè)證書編號(hào)為:國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2014第3401227號(hào)，其特異度、靈敏度分別為95.36%和96.36%，能夠滿足實(shí)驗(yàn)檢測(cè)需要。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣本的采集與保存 以專用宮頸脫落細(xì)胞采集器進(jìn)行采樣。醫(yī)護(hù)人員先以窺陰器或陰道張開器暴露宮頸，用棉拭子將宮頸口過多的分泌物擦去。取出宮頸刷置于宮頸口，單方向旋轉(zhuǎn)4～5周以獲得足量的上皮細(xì)胞樣本，然后將宮頸刷頭部放入洗脫管中，沿刷柄折痕處將宮頸刷柄折斷，旋緊洗脫管蓋，洗脫管中已加有專用細(xì)胞保存液，做好樣本標(biāo)識(shí)4 ℃保存待檢，保存不超過24 h。-20 ℃保存不超過3個(gè)月，樣本應(yīng)避免反復(fù)凍融。

1.3.2HPV-DNA的提取 充分洗脫宮頸刷，并在管壁上擠干。把洗脫液全部轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，13 000 r/min,離心10 min,棄去上清液，保留管底的細(xì)胞沉淀。加入50 μL裂解液懸浮沉淀，沸水浴加熱10 min，13 000 r/min,離心10 min，保留上清液待用。

1.3.3聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增 取出反應(yīng)液1及反應(yīng)液2各1管，做好標(biāo)記，低速離心數(shù)秒，然后分別加入已提取的待測(cè)樣品DNA 5 μL，反應(yīng)總體系為25 μL，低速離心數(shù)秒待PCR擴(kuò)增。PCR按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增:50 ℃ 15 min;95 ℃ 10 min;然后以94 ℃ 30 s;42 ℃ 90 s;72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。

1.3.4雜交 取15 mL塑料離心管，放入標(biāo)有患者編號(hào)的膜條，加入A液5～6 mL及所有對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物，將蓋擰緊。將離心管放入沸水浴中加熱10 min，取出放入雜交箱51 ℃雜交1.5 h。

1.3.5膜條處理 洗膜取出膜條，移至裝有B液的50 mL管中，于51 ℃輕搖洗滌5 min。

1.3.6顯色及結(jié)果判定 按HPV基因分型檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行雜交顯色，顯色結(jié)果亦按說(shuō)明書進(jìn)行判定。膜條上探針按固定順序排列，由藍(lán)色斑點(diǎn)顯現(xiàn)位置即可斷定HPV的亞型。其中，高危型17種包括:HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82;低危型6種包括:HPV6、11、42、43、81、83。PC為顯色質(zhì)控點(diǎn)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同年份檢測(cè)情況及感染率 2012-2018年，本院HPV項(xiàng)目就診及體檢人數(shù)分別為812、766、853、1 943、3 972、4 470、3 935例，隨著宮頸癌科普知識(shí)的宣傳及婦女對(duì)自身健康體檢需求增加，HPV檢測(cè)人數(shù)有逐年增加趨勢(shì)，但是感染率逐年減低。16 751例受檢人數(shù)共檢測(cè)陽(yáng)性病例4 568例，HPV感染率為27.27%。見表1。

表1 2012-2018年賀州市HPV受檢人數(shù)及感染率

2.2HPV感染各亞型分布狀況 16 751例女性中有4 568例感染HPV，檢出頻數(shù)最高的型別是HPV52型，檢出構(gòu)成比為16.77%(1 011/6 029)，也是單一陽(yáng)性率及多重陽(yáng)性率最高的亞型，分別為18.62%(629/3 378)和14.41%(382/2 651)；HPV各亞型的構(gòu)成比中排在前3位的是HPV52、16、58，感染率明顯高于其他亞型，構(gòu)成比分別為16.77%、14.21%、8.46%。見表2。

表2 4 568例感染者HPV各亞型構(gòu)成情況

2.3不同年齡組HPV感染狀況分析 16 751例送檢者年齡為10～92歲，以25～49歲最多，共12 532例，占74.81%。在所有年齡組中<20歲年齡組感染率最高，達(dá)56.86%；其次是≥55歲年齡組，感染率為41.54%；35～39歲年齡組感染率相對(duì)較低，感染率為22.48%。<20歲年齡組HPV感染率與其他各年齡組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)?！?5歲年齡組與25～54歲年齡組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與<25歲年齡組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?！?5歲年齡組高危型明顯高于其他年齡組30.77%，<20歲組的低危型、高低?；旌闲透腥韭示黠@高于其他年齡組，分別為18.14%和22.55%。其他年齡組中感染率相對(duì)較高的有:50～54歲年齡組單純高危型感染率為22.22%；20～24歲年齡組單純低危型感染為9.09%；高低?；旌闲椭幸彩且浴?5歲年齡組較高，占7.09%。見表3。

2.4HPV單一感染和多重感染分布狀況 HPV感染存在多種亞型同時(shí)感染的情況，不同年齡組均可出現(xiàn)HPV單一感染和多重感染情況,以單一感染病例為主，在HPV陽(yáng)性病例中檢出單一型感染病例3 359例,占73.53%(3 359/4 568)；二重感染為兩種亞型陽(yáng)性，占18.89%(863/4 568)，HPV多重感染指同時(shí)感染HPV 3種及以上亞型病例，其中三重感染占5.06%(231/4 568)，四重感染占1.58%(72/4 568)，五重及以上感染占0.94%(43/4 568)。單一型感染中35～39歲組感染率最高為82.79%(486/587)，35～39歲年齡組單一型感染率與<30歲及≥50歲年齡組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與30～34歲、40～49歲年齡組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。二重感染中20～24歲組感染率最高為24.79%(90/363)，20～24歲組二重感染率與30～54歲年齡組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表3 不同年齡組HPV感染狀況

表4 HPV 單一感染和多重感染在各年齡組的感染率

3 討 論

本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)賀州地區(qū)女性的HPV感染情況進(jìn)行了大規(guī)模樣本的調(diào)查，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2012-2018年檢測(cè)人數(shù)及陽(yáng)性人數(shù)持續(xù)增加,而感染率逐年降低。分析原因可能是患者及醫(yī)生對(duì)HPV檢測(cè)及防御意識(shí)增加。16 751例樣本中HPV感染者4 568例，感染率為27.27%，調(diào)查結(jié)果與中國(guó)西南地區(qū)(26.2%)[11]、浙江省湖州地區(qū)(26.83%)[12]、上海地區(qū)(28.5%)[13]及山東地區(qū)(29.00%)[14]較接近，明顯高于成都地區(qū)(17.60%)[15]、武漢地區(qū)(17.46%)[16]、珠海地區(qū)(21.37%)[17]，明顯低于遼寧地區(qū)(45.60%)[18]、重慶地區(qū)(37.30%)[19]及廣州地區(qū)(35.00%)[20]，提示HPV感染在不同地區(qū)有較大差異，亞型的分布在各地區(qū)較為一致。HPV各亞型在4 568例陽(yáng)性樣本中HPV52、16、58感染率明顯高于其他亞型，分別為16.77%、14.21%、8.46%，說(shuō)明這3種亞型是易感亞型，結(jié)果與我國(guó)其他地區(qū)報(bào)道一致[21]，也符合亞洲人群研究結(jié)果，在亞洲宮頸癌病例中，HPV58比歐洲及非洲更為常見。但與國(guó)外人群有差異，美國(guó)感染率前3位基因型為HPV16、53、52[22]，芬蘭為HPV16、31、52[23]。而這3種亞型都為高危型，應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注，加強(qiáng)防范，該研究對(duì)該地區(qū)HPV疫苗的研制重點(diǎn)起到了較好的提示作用。16 751例送檢者年齡為10～92歲，以25～49歲最多，共12 532例，占74.81%,說(shuō)明該年齡段人群對(duì)HPV篩查有較強(qiáng)的意識(shí)，對(duì)早發(fā)現(xiàn)、早治療起到了較好的預(yù)防作用。在所有年齡組中<20歲年齡組陽(yáng)性率最高，達(dá)56.86%，可以看出該年齡段人群為HPV感染的易感人群，而該年齡段人群的自我保護(hù)意識(shí)較差，對(duì)HPV篩查的認(rèn)識(shí)還不到位，應(yīng)加強(qiáng)該人群的自我保護(hù)意識(shí)，對(duì)該人群加大宣傳HPV篩查重要性的力度，及時(shí)接種HPV疫苗；其次是≥55歲年齡組，感染率為41.54%，可能與該人群的免疫力下降有關(guān);35～39歲年齡組感染率相對(duì)較低，說(shuō)明該年齡段人群的自我保護(hù)意識(shí)、HPV篩查意識(shí)和免疫力較強(qiáng)。

HPV單一感染占73.53%，二重感染為兩種亞型陽(yáng)性，占18.89%，三重感染占5.06%，四重感染占1.58%，五重及以上感染占0.94%。說(shuō)明HPV感染亞型以單一亞型感染為主，與國(guó)內(nèi)報(bào)道的單一感染是HPV感染的主要形式一致[24-25]，單一亞型感染率最高的是35～39歲年齡組，為82.79%，與拉丁美洲、加勒比地區(qū)及非洲大多數(shù)國(guó)家報(bào)道的45歲不同[26]。有研究報(bào)道芬蘭有一個(gè)<25歲的高峰[23]。二重亞型感染率最高的是20～24歲年齡組為24.79%，可能與性行為，宿主易感性和病毒特征有關(guān)。三重及四重亞型感染率最高的均是<20歲年齡組，分別為14.41%和10.17%，說(shuō)明該年齡段人群易感三重和四重亞型，可能與該人群的自我保護(hù)意識(shí)較差，對(duì)HPV的認(rèn)知尚淺，且發(fā)育不成熟有關(guān)。五重及以上感染率最高的是≥55歲年齡組為3.13%，可能與該年齡段人群的生理絕經(jīng)期和免疫力下降有關(guān)。

調(diào)查研究結(jié)果顯示，賀州地區(qū)HPV高危感染率占72.50%，低危感染占15.28%，高低?；旌细腥菊?2.22%，說(shuō)明感染類型多以高危型為主。而在高危型感染人群中，又以≥55歲年齡組單純高危型為主，占30.77%，主要與該年齡段女性處于生理絕經(jīng)期和免疫力下降導(dǎo)致HPV持續(xù)感染或潛伏感染病毒復(fù)活有關(guān)，且大部分因?yàn)橛猩车腊Y狀而就診。高風(fēng)險(xiǎn)HPV基因型感染是宮頸癌的重要危險(xiǎn)因素[27]，體現(xiàn)出高風(fēng)險(xiǎn)HPV檢測(cè)的重要性[28]，隨著人口老齡化，絕經(jīng)后的婦女是宮頸癌篩查策略中重點(diǎn)考慮的新群體。<20歲年齡組低危感染和高低?；旌细腥靖腥韭首罡?，說(shuō)明HPV感染有低齡化多亞型化傾向，此類感染人群感染率高，可能與宮頸環(huán)境未成熟，檢測(cè)標(biāo)本數(shù)量少，且多數(shù)患者已有相應(yīng)癥狀有關(guān)。持續(xù)HPV高危型感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件，HPV檢查是目前預(yù)防及控制宮頸癌發(fā)生的主要手段，同時(shí)加強(qiáng)不同年齡段HPV疫苗接種。在美國(guó)，2015年，42%的女孩和28%的13～17歲男孩接受了所有3種疫苗劑量[29]。有調(diào)查顯示，在西安市第四醫(yī)院婦科門診單純隨機(jī)抽取前來(lái)就診的患者1 000例,采用自行設(shè)計(jì)的問卷進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，西安市門診患者對(duì)HPV及其疫苗的知曉率較低,應(yīng)加強(qiáng)公眾健康教育宣傳力度,普及HPV疫苗相關(guān)知識(shí)[30]。

4 結(jié) 論

賀州市HPV感染普遍存在于不同健康狀態(tài)的女性中,以單一感染高危型為主。本研究首次對(duì)賀州地區(qū)女性進(jìn)行大樣本回顧性分析HPV感染和基因類型分析，HPV基因分型研究對(duì)于建立宮頸癌篩查和HPV疫苗接種策略非常重要,對(duì)賀州地區(qū)的宮頸癌的防治提供了科學(xué)的理論依據(jù)。