陳文靜，劉 平

0 引言

白內(nèi)障是一種表現(xiàn)為晶狀體混濁化的眼病，除老齡化因素外，最常見的危險(xiǎn)因素為糖尿病[1]。近30a全國流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國糖尿病患者數(shù)量增長了17倍，是新的流行病之一[2]。糖尿病性白內(nèi)障(diabetic cataract，DC)會(huì)降低患者生活質(zhì)量并影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，已成為重大的公共衛(wèi)生問題[3]。研究表明，白內(nèi)障發(fā)生的基本病理改變是人晶狀體上皮(human lens epithelial，HLE)細(xì)胞的凋亡，高糖可能誘導(dǎo)HLE細(xì)胞凋亡，而氧化應(yīng)激損傷是主要原因[4]。無氧酵解的代謝通路可代謝晶狀體內(nèi)的大部分葡萄糖，三羧酸循環(huán)代謝因需氧而較少發(fā)生。DC的形成與葡萄糖關(guān)鍵代謝酶的改變關(guān)系密切，其表達(dá)情況和作用機(jī)制并未被完全闡明，具有較高的研究價(jià)值。

圖1各組細(xì)胞凋亡情況(×400)A：正常對(duì)照組；B：氧化應(yīng)激組；C：高糖誘導(dǎo)組。

表1 引物序列

基因名稱上游引物下游引物β-actinGTCCACCGCAAATGCTTCTATGCTGTCACCTTCACCGTTCPFK-1CTACAGTCTCCAACAATGTCCCCACCCATAGTCTCAATGATAPKM1CATTCATCCGCAAGGCATCTGCACCGTCCAATCATCATCTTCHKTGTGAGGTCCACTCCAGATGGCCCATTGTCCCTTACTTTCCSAGGTCTGGGAGTGTTCTGTTTAGGTAGTGGCTTGTATTCTGTOGDCCTTGAGCCTGAGCCTTAGAATCAGGAACAGCAGATAATGGACACG6PDGGAGAATGAGAGGTGGGATGACTGCTGGTGGAAGATGTCG

1材料和方法

1.1材料人晶狀體上皮細(xì)胞系(HLEB3細(xì)胞，中國廣州吉妮歐生物科技有限公司)；胎牛血清(FBS，以色列BI)，青霉素/鏈霉素(美國Gibco公司)，DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(中國安必信)，噻唑蘭(MTT，北京賽因坦科技有限公司)，二甲基亞砜(美國Sigma)，總RNA提取試劑盒(中國愛思進(jìn))，cDNA試劑盒(日本TOYOBO)，熒光定量PCR試劑盒(日本TOYOBO)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo)，酶標(biāo)儀(美國BioTek)，倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)，Nanodrop 2000c分光光度儀(美國Thermo)，7500 Fast實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國ABI)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理使用含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM培養(yǎng)液(葡萄糖5mmol/L)于37℃、體積分?jǐn)?shù) 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HLEB3細(xì)胞，2～3d換液，傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞呈現(xiàn)對(duì)數(shù)生長時(shí)分為3組：正常對(duì)照組(采用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，含葡萄糖5mmol/L)、氧化應(yīng)激組(采用含H2O2200μmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng))、高糖誘導(dǎo)組(采用含葡萄糖30mmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng))，均培養(yǎng)24h后進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測在6孔培養(yǎng)板底部鋪蓋玻片，將對(duì)數(shù)生長期的HLEB3細(xì)胞接種于其上，每孔2mL，約1×105個(gè)細(xì)胞，分組培養(yǎng)24h后用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，在500μL 1×Binding Buffer 中加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，輕輕混勻，將混合液加于蓋玻片表面，使蓋玻片表面均勻覆蓋，避光室溫反應(yīng)15min，將蓋玻片倒置于載玻片上，使用熒光顯微進(jìn)行雙色濾光片觀察。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力將對(duì)數(shù)生長期的HLEB3細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，約1×104個(gè)細(xì)胞，周圍孔各用100μL PBS緩沖液填充，并設(shè)立凋零孔。分組培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)孔每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，將上清液去掉，每孔加入150μL二甲基亞砜，使用振蕩器低速振蕩10min，充分溶解結(jié)晶物。使用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm處測定各孔的OD值。細(xì)胞活性=(實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零孔OD值)/(正常對(duì)照組OD值-調(diào)零孔OD值)×100%。

1.2.4 qRT-PCR 檢測mRNA的表達(dá)將對(duì)數(shù)生長期的HLEB3細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板中，每孔2mL，約1×105個(gè)細(xì)胞，分組培養(yǎng)24h后提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測RNA濃度(A260/A280)。使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測6種葡萄糖關(guān)鍵代謝酶[6-磷酸果糖激酶-1(PFK-1)、丙酮酸激酶(PKM1)、己糖激酶(HK)、檸檬酸合成酶(CS)、α-酮戊二酸脫氫酶(OGDC)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)]mRNA的表達(dá)，引物序列見表1。反應(yīng)條件：預(yù)變性(95℃ 20s)，PCR反應(yīng)(95℃ 3s，60℃ 60s，40循環(huán)),溶解曲線(95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s)。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測熒光顯微鏡下觀察，正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡發(fā)生較少，氧化應(yīng)激組和高糖誘導(dǎo)組細(xì)胞均發(fā)生凋亡，且高糖誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡現(xiàn)象最顯著，可見凋亡的HLEB3細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松，有空泡形成，細(xì)胞核大小不一，狀態(tài)不佳，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞有重疊現(xiàn)象，見圖1。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力MTT實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、氧化應(yīng)激組、高糖誘導(dǎo)組HLEB3細(xì)胞活力分別為100.00%±0.00%、91.90%±5.11%、63.43%±3.40%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.968，P=0.001)。與正常對(duì)照組相比，氧化應(yīng)激組和高糖誘導(dǎo)組細(xì)胞活力均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且高糖誘導(dǎo)組細(xì)胞活力低于氧化應(yīng)激組。

葡萄糖關(guān)鍵代謝酶正常對(duì)照組氧化應(yīng)激組高糖代謝組FPPFK-11.00±0.001.0810±0.02010.8665±0.038119.2340.002PKM11.00±0.000.6941±0.02820.6285±0.0331112.809<0.001HK1.00±0.001.1276±0.05500.8029±0.054457.002<0.001CS1.00±0.001.2058±0.05560.7791±0.0127101.054<0.001OGDC1.00±0.001.2030±0.11220.7702±0.052332.4880.001G6PD1.00±0.001.0817±0.04030.8970±0.016733.3830.001

圖2三組細(xì)胞6種葡萄糖關(guān)鍵代謝酶mRNA表達(dá)情況。

2.3 qRT-PCR法檢測6種葡萄糖關(guān)鍵代謝酶的mRNA表達(dá)qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、氧化應(yīng)激組、高糖誘導(dǎo)組6種葡萄糖關(guān)鍵代謝酶的mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。氧化應(yīng)激組細(xì)胞除丙酮酸激酶外的5種葡萄糖關(guān)鍵代謝酶的表達(dá)均高于正常對(duì)照組，而丙酮酸激酶的表達(dá)低于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高糖誘導(dǎo)組細(xì)胞6種葡萄糖關(guān)鍵代謝酶的表達(dá)均低于正常對(duì)照組和氧化應(yīng)激組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2，圖2。

3討論

白內(nèi)障是由多種致病機(jī)制共同作用的結(jié)果，已知糖尿病性白內(nèi)障形成的機(jī)制有滲透壓改變、蛋白質(zhì)糖基化和氧化應(yīng)激等[5]。氧化應(yīng)激是細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化的失衡狀態(tài)，參與了細(xì)胞內(nèi)的多種病理過程，白內(nèi)障發(fā)生過程中最基本的一個(gè)環(huán)節(jié)是晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，也是病理學(xué)基礎(chǔ)[4]。金子夜等[6]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜細(xì)胞凋亡程度較年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者嚴(yán)重，且檢測到凋亡相關(guān)基因的表達(dá)在糖尿病性白內(nèi)障患者高于年齡相關(guān)性白內(nèi)障。H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激是眼科常用的模擬年齡相關(guān)性白內(nèi)障導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型的方法，本實(shí)驗(yàn)使用高糖作為誘導(dǎo)條件，模擬糖尿病性白內(nèi)障患者體內(nèi)高糖狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)的HLEB3細(xì)胞發(fā)生凋亡顯著，細(xì)胞活力明顯下降，且細(xì)胞凋亡程度較H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激組更加嚴(yán)重。

湯志錚等[7]在最近的研究中發(fā)現(xiàn)糖尿病性白內(nèi)障與糖代謝異常關(guān)系密切。葡萄糖參與的代謝途徑主要有無氧酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑等。在糖代謝的某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都能影響葡萄糖代謝水平，引起代謝障礙，進(jìn)而影響白內(nèi)障的形成[8]。己糖激酶是無氧酵解的關(guān)鍵酶，將進(jìn)入細(xì)胞的葡萄糖磷酸化為6-磷酸葡萄糖，為其它途徑提供底物6-磷酸葡萄糖和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)，參與糖原合成和磷酸戊糖途徑[9]。已有研究證明，在高糖條件下，己糖激酶被葡萄糖飽和，山梨醇途徑被激活，山梨醇過多堆積造成細(xì)胞功能退化促成糖尿病性白內(nèi)障[10]。山梨醇途徑在眼科研究較多，是公認(rèn)的糖尿病性白內(nèi)障形成的機(jī)制之一[11]。6-磷酸果糖激酶-1和丙酮酸激酶是糖酵解途徑的另外兩種關(guān)鍵酶，目前在眼科研究較少。三羧酸循環(huán)參與糖、蛋白質(zhì)和脂肪的代謝過程是產(chǎn)生能量腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)的主要方式，檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)最重要的酶，可以催化縮合反應(yīng)產(chǎn)生大量的檸檬酸[11]。α-酮戊二酸脫氫酶也是其重要關(guān)鍵酶，能夠產(chǎn)生活性氧，在缺氧損傷時(shí)其表達(dá)會(huì)抑制，活性受到影響[8]。葡萄糖的磷酸戊糖途徑是產(chǎn)生NADPH和核糖-5-磷酸的途徑，其關(guān)鍵酶為6-磷酸葡萄糖脫氫酶。

本研究發(fā)現(xiàn)，6種葡萄糖關(guān)鍵代謝酶在高糖誘導(dǎo)組細(xì)胞的表達(dá)均低于正常對(duì)照組，可以認(rèn)為在高糖誘導(dǎo)的情況下，葡萄糖代謝的無氧酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑均因?yàn)槊傅臏p少，受到了不同程度的抑制，葡萄糖代謝功能失常，使大量葡萄糖堆積于細(xì)胞內(nèi)，無氧條件下且ATP產(chǎn)生不足，促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而可能促進(jìn)了山梨醇途徑，加快了白內(nèi)障的生成進(jìn)程。此外，我們發(fā)現(xiàn)6種葡萄糖關(guān)鍵代謝酶在高糖誘導(dǎo)組細(xì)胞的表達(dá)水平均低于氧化應(yīng)激組，說明這些酶表達(dá)的減少現(xiàn)象發(fā)生在高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞中是糖尿病性白內(nèi)障所具有的。氧化應(yīng)激組細(xì)胞除丙酮酸激酶外的5種關(guān)鍵酶表達(dá)均高于正常對(duì)照組，表明在氧化應(yīng)激過程中HLEB3細(xì)胞的糖代謝過程大部分被促進(jìn)，產(chǎn)生大量的能量。高糖誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡較氧化應(yīng)激組嚴(yán)重，6種葡萄糖關(guān)鍵酶表達(dá)反而下降，在高糖狀態(tài)下為了減少細(xì)胞內(nèi)葡萄糖，大量的酶被消耗，使糖代謝被抑制，加快了細(xì)胞凋亡，進(jìn)而加快了白內(nèi)障的形成速度。表明葡萄糖代謝途徑受阻會(huì)加速晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡，葡萄糖關(guān)鍵代謝酶可以起到一定程度的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果表明，高糖可以誘導(dǎo)HLEB3細(xì)胞葡萄糖關(guān)鍵代謝酶的表達(dá)水平降低，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞活性。由此可見，糖尿病性白內(nèi)障的形成與糖代謝異常密不可分，未來有望通過調(diào)控糖代謝途徑進(jìn)行預(yù)防，達(dá)到控制甚至逆轉(zhuǎn)晶狀體混濁的目標(biāo)。