余苗苗，江敏,2,*，吳昊，吳丹，金若晨，孫世玉，姚丹，王旭娜

1. 上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306 2. 上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306 3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponensis)又名青蝦、河蝦，隸屬甲殼綱類，十足目，長(zhǎng)臂蝦科，沼蝦屬[1]，具有較高的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蝦類之一。據(jù)2017年《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》統(tǒng)計(jì)，我國(guó)蝦類養(yǎng)殖產(chǎn)量203.21萬(wàn)t，其中日本沼蝦27.26萬(wàn)t，較2016年增長(zhǎng)2.84%[2]。在大規(guī)模的集約化養(yǎng)殖模式下，養(yǎng)殖管理措施不當(dāng)會(huì)造成池塘底部殘餌及糞便的積累，引起水質(zhì)惡化，致使蝦體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，攝食能力和自身免疫下降，嚴(yán)重時(shí)會(huì)危害蝦的生長(zhǎng)與存活[3-4]。

氨與亞硝酸鹽是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常見(jiàn)的污染物，兩者來(lái)自于水生生物的直接代謝和環(huán)境中有機(jī)物的分解轉(zhuǎn)化。其中，非離子氨會(huì)破壞水生動(dòng)物的排泄系統(tǒng)及滲透平衡，損傷組織結(jié)構(gòu)，致使代謝紊亂等，嚴(yán)重時(shí)可致動(dòng)物死亡[5-7]。有研究表明，水中過(guò)高的亞硝酸鹽進(jìn)入魚(yú)蝦體內(nèi)后，會(huì)導(dǎo)致血淋巴pH降低，進(jìn)而影響生物體內(nèi)氧的運(yùn)輸，擾亂氮排泄及損壞器官等[8-9]。肝胰腺是甲殼綱動(dòng)物脂質(zhì)儲(chǔ)存和加工的重要器官，是消化、吸收和代謝的主要場(chǎng)所[10]，也是受氨及亞硝酸鹽毒性損害的主要部位之一。冼健安等[11]研究發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對(duì)蝦肝胰腺中氨氮的含量顯著高于血淋巴、鰓和肌肉中的含量，且更易于積累其中。蔣琦辰等[12]研究發(fā)現(xiàn)，隨著氨氮濃度的升高，紅螯光殼螯蝦幼體肝胰腺中的可溶性蛋白和甘油磷脂會(huì)受到抑制，含量降低。Zhou等[13]證實(shí)氨氮脅迫會(huì)造成斑節(jié)對(duì)蝦肝胰腺和鰓中幾丁質(zhì)(PmChi-4)含量的減少。蝦體內(nèi)相關(guān)酶的活性如超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)在亞硝酸氮的脅迫下會(huì)受到不同程度的影響，從而影響蝦的生長(zhǎng)代謝[14-15]。亞硝酸鹽與氨對(duì)日本沼蝦的脅迫會(huì)對(duì)其養(yǎng)殖產(chǎn)量產(chǎn)生較大影響[16-17]，繼而導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，關(guān)于亞硝酸鹽和氨對(duì)于蝦類的毒性研究，多集中在高濃度時(shí)對(duì)蝦生長(zhǎng)及生理活動(dòng)、免疫功能等方面的影響。但在運(yùn)用代謝組學(xué)探究低濃度亞硝酸鹽和氨對(duì)日本沼蝦的毒性機(jī)制方面的研究鮮有報(bào)道。本文基于養(yǎng)殖生產(chǎn)中通常濃度的亞硝酸鹽、氨，從代謝組學(xué)角度探討其對(duì)日本沼蝦肝胰腺的影響，從而對(duì)指導(dǎo)蝦類的養(yǎng)殖生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用日本沼蝦取自上海青浦區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)，平均體質(zhì)量(1.8±0.3) g，體長(zhǎng)(0.5±0.2) cm。正式實(shí)驗(yàn)前，于水箱(長(zhǎng)×寬×高=1.5 m×1.8 m×1.2 m，內(nèi)含350 L經(jīng)充分曝氣除氯的自來(lái)水)中暫養(yǎng)一周。暫養(yǎng)期間控制水溫為(21±0.5) ℃，pH為(8.2±0.1)，溶解氧為(6.0±0.5) mg·L-1，每天定時(shí)投喂適量餌料，喂食30 min后更換1/4體積水，及時(shí)清除殘餌及排泄物，暫養(yǎng)期間死亡率低于10%。

試劑：HPLC級(jí)甲醇(Sigma)，HPLC級(jí)水(Sigma-Aldrich公司)，N,O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSTFA)，含1%茶渣微晶纖維素(TMCC)(上海安譜)，分析純吡啶(Sigma-Aldrich公司)，分析純甲氧基胺鹽酸鹽(Sigma-Aldrich公司)，分析純2-氯苯丙氨酸(Sigma-Aldrich公司)。分析純NH4Cl和NaNO2(國(guó)藥集團(tuán))，用蒸餾水將NaNO2和NH4Cl配制成10 g·L-1的母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

儀器：液質(zhì)聯(lián)用儀(Waters, Q-Tof)，氣質(zhì)聯(lián)用儀(Algilent, 7890A/5975)；全自動(dòng)快速研磨儀(上海凈信科技，Tissuelyser-24)，離心機(jī)(Eppendor, Centrifuge 5810 R)，高速離心濃縮儀(Labogene, 2236R)，恒溫混勻儀(杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司，TS100)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)

課題組對(duì)上海青浦、奉賢等區(qū)的淡水蝦類池塘水質(zhì)進(jìn)行了持續(xù)監(jiān)測(cè)，在所獲近3萬(wàn)個(gè)數(shù)據(jù)中，一個(gè)養(yǎng)殖周期內(nèi)蝦塘氨氮通常在0.1～2.0 mg·L-1范圍內(nèi)，且多在1.0 mg·L-1附近波動(dòng)；亞硝氮多為0.001～0.6 mg·L-1，且養(yǎng)殖初期即會(huì)快速升至0.25 mg·L-1以上。因此設(shè)置了3組不同濃度的亞硝酸鹽，分別為對(duì)照組(≤0.05 mg·L-1)、低脅迫組(0.25 mg·L-1)、高脅迫組(0.5 mg·L-1)；氨脅迫預(yù)實(shí)驗(yàn)共設(shè)3組，分別為對(duì)照組(pH=8.0，總氨氮(TAN)≤0.1 mg·L-1，即非離子氨氮小于0.005 mg·L-1)、低脅迫組(pH=8.6，TAN=1.0 mg·L-1，即非離子氨氮為0.152 mg·L-1)、高脅迫組(pH=9.0，TAN=1.0 mg·L-1，即非離子氨氮為0.378 mg·L-1)。每組實(shí)驗(yàn)水箱(體積48 cm×36 cm×28 cm)含有30 L經(jīng)充分曝氣處理的自來(lái)水，分別放入6尾日本沼蝦，其余養(yǎng)殖管理同暫養(yǎng)期間，脅迫實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5 d后采集蝦樣。

取樣時(shí)，迅速將日本沼蝦置于液氮中快速冷凍，在冰上解剖取其肝胰腺組織，每尾蝦取其肝胰腺樣本約30 mg于離心管中作為一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本，在裝有樣品的離心管內(nèi)加入20 μL內(nèi)標(biāo)化合物(0.3 mg·L-1的2-氯苯丙氨酸)以及800 μL提取液(甲醇∶水=4∶1，V/V)，勻漿后于-20 ℃冰箱靜置10 min后取出，10 000 r·min-1離心10 min，取200 μL上清液于色譜瓶中用于液質(zhì)聯(lián)用的檢測(cè)；另取200 μL上清液于樣品瓶中，干燥后經(jīng)BSTFA硅烷化，用于氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)。

1.2.2 正式實(shí)驗(yàn)

對(duì)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行主成分分析，與對(duì)照組相比，對(duì)日本沼蝦肝胰腺代謝產(chǎn)物有顯著影響的實(shí)驗(yàn)組為亞硝酸鹽氮濃度為0.5 mg·L-1和高濃度氨(pH=9.0，TAN=1.0 mg·L-1，即非離子氨0.378 mg·L-1)脅迫組。因此，后續(xù)亞硝酸鹽脅迫設(shè)4個(gè)不同脅迫時(shí)間組：對(duì)照組(C)、脅迫2 d實(shí)驗(yàn)組(NO2-2d)、脅迫3 d實(shí)驗(yàn)組(NO2-3d)與脅迫5 d實(shí)驗(yàn)組(NO2-5d)，其中亞硝酸鹽氮濃度均為0.5 mg·L-1；pH=9.0，TAN為1.0 mg·L-1條件下設(shè)4個(gè)不同脅迫時(shí)間組：對(duì)照組(C)、脅迫2 d實(shí)驗(yàn)組(TAN-2d)、脅迫3 d實(shí)驗(yàn)組(TAN-3d)和脅迫5 d實(shí)驗(yàn)組(TAN-5d)，各組設(shè)定脅迫時(shí)間截止時(shí)采集蝦樣，樣品處理方法同“1.2.1”。

1.2.3 定量實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過(guò)對(duì)pH=9.0，TAN=1.0 mg·L-1的氨脅迫2 d實(shí)驗(yàn)組(TAN-2d)差異代謝物的鑒定及代謝通路分析，在與對(duì)照組有顯著性差異的化合物中發(fā)現(xiàn)了草酰乙酸、α-酮戊二酸等三羧酸循環(huán)的相關(guān)代謝物。因此，對(duì)pH=9.0、TAN為1.0 mg·L-1的氨氮組進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，設(shè)置脅迫時(shí)間分別為12 h、24 h和48 h，采用氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)日本沼蝦肝胰腺中的草酰乙酸、檸檬酸、L-谷氨酸、α-酮戊二酸進(jìn)行定量測(cè)定。截止時(shí)間采集蝦樣，樣品處理方法同“1.2.1”。

1.3 氣相、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Algilent, 7890A/5975)檢測(cè)使用HP-5MS毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣體積為1 μL，進(jìn)樣口溫度為260 ℃，初始溫度為60 ℃，以10 ℃min-1的速度升到315 ℃，恒定流速1.0 mL·min-1；EI離子源能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍70～600 amu；以全掃描模式獲得總離子流色譜圖。

液質(zhì)聯(lián)用(Waters, Q-Tof)，流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫條件：0～2 min，2% B；2～10 min，100% B；10～12 min，100% B；12.1 min，2% B；12.1～15 min，2% B。流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣體積2 μL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

氣質(zhì)聯(lián)用及液質(zhì)聯(lián)用數(shù)據(jù)由Mass Hunter軟件和QI軟件進(jìn)行歸一化處理，并獲得樣品代謝組份及豐度的矩陣信息。用SIMCA 14.1軟件，對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA和OPLS-DA分析并篩選得到差異代謝物，在OPLS-DA分析結(jié)果的S-Splot圖中，選擇∣p(corr)∣>0.5、∣p∣>0.1、VIP值>1.0且P值<0.05的差異代謝物。通過(guò)NIST譜庫(kù)檢索，利用HMDB、Lipids和KEGG等在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物的結(jié)構(gòu)、名稱進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)，首先結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、液質(zhì)聯(lián)儀用所得結(jié)果，篩選出實(shí)驗(yàn)組中與對(duì)照組有顯著差異性的代謝物，再將所鑒定出的帶有HMDB和KEGG編號(hào)的差異性代謝物輸入Metabo Analyst 3.0在線通路分析數(shù)據(jù)庫(kù)，并依次查看差異性代謝物在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中所對(duì)應(yīng)的代謝通路。

2 結(jié)果(Results)

2.1 亞硝酸鹽對(duì)日本沼蝦肝胰腺代謝的影響

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后選擇了亞硝酸鹽氮濃度為0.5 mg·L-1來(lái)進(jìn)行脅迫實(shí)驗(yàn)，時(shí)間設(shè)置分別為2、3和5 d。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)主成分分析(PCA)(圖1)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組(NO2-2d)間的代謝輪廓呈明顯的分離趨勢(shì)，即經(jīng)0.5 mg·L-1亞硝酸鹽脅迫2 d后，日本沼蝦肝胰腺代謝和對(duì)照組之間產(chǎn)生了顯著差異；而脅迫3 d與5 d組則與對(duì)照組區(qū)分不明顯，推測(cè)脅迫3 d、5 d后，其新陳代謝有恢復(fù)的可能。隨后，對(duì)對(duì)照組(C-2d)和實(shí)驗(yàn)組(NO2-2d)進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證，用正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)對(duì)肝胰腺的代謝數(shù)據(jù)作進(jìn)一步分析，結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3，表示模型解釋能力的參數(shù)RX2=0.834，表示模型預(yù)測(cè)能力的參數(shù)Q2=0.712，說(shuō)明模型可靠。由此可知模型對(duì)自變量的擬合能力和預(yù)測(cè)能力良好，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組在肝胰腺代謝譜中均可以明顯區(qū)分。

圖1 日本沼蝦經(jīng)0.5 mg·L-1的亞硝酸鹽脅迫后肝胰腺的代謝化合物主成分(PCA)得分圖注：C代表對(duì)照組，NO2-5代表亞硝酸鹽(0.5 mg·L-1)脅迫5 d的實(shí)驗(yàn)組，NO2-3代表亞硝酸鹽(0.5 mg·L-1)脅迫3 d的實(shí)驗(yàn)組， NO2-2代表亞硝酸鹽(0.5 mg·L-1)脅迫2 d的實(shí)驗(yàn)組，NO2-5-x、NO2-3-x和NO2-2-x代表各組內(nèi)的平行樣本，即第1至第6尾蝦。Fig. 1 PCA score plots of metabolites in Macrobrachium nipponensis hepatopancreas in control group and experimental groups exposed to NO2-N (0.5 mg·L-1) Note: C is control group; NO2-5 is experimental group exposed to NO2-N (0.5 mg·L-1) for 5 d; NO2-3 is experimental group exposed to NO2-N (0.5 mg·L-1) for 3 d; NO2-2 is experimental group exposed to NO2-N (0.5 mg·L-1) for 2 d; NO2-5-x, NO2-3-x and NO2-2-x is a parallel sample of each group, from the frist shrimp to the sixth.

圖2 日本沼蝦經(jīng)0.5 mg·L-1亞硝酸鹽脅迫2 d后,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組肝胰腺代謝化合物的正交偏最小二乘法(OPLS-DA)得分圖注：C代表對(duì)照組，NO2代表亞硝酸鹽(0.5 mg·L-1)脅迫2 d的實(shí)驗(yàn)組，NO2-x是實(shí)驗(yàn)組內(nèi)的平行樣本，即第1至第6尾蝦。Fig. 2 OPLS-DA score plots of metabolites in Macrobrachium nipponensis hepatopancreas in control group and experimental groups exposed to NO2-N (0.5 mg·L-1) for 2 d Note: C is control group; NO2 is experimental group exposed to NO2-N (0.5 mg·L-1) for 2 d; NO2-x is a parallel sample of each group, from the frist shrimp to the sixth.

圖3 OPLS-DA得分圖(圖2)的交互驗(yàn)證圖注：R2表示累計(jì)方差值，Q2表示累計(jì)交叉有效性。Fig. 3 Permutation test of OPLS-DA score plots (figure 2) Note: R2 stands for cumulative variance; Q2 stands for cumulative cross validity.

表1 0.5 mg·L-1亞硝酸鹽脅迫組(2 d)與對(duì)照組日本 沼蝦肝胰腺代謝物中具有顯著差異的成分列表Table 1 Differential metabolites in Macrobrachium nipponensis hepatopancreas between 0.5 mg·L-1 NO2-2 (2 d) exposure group and control group

注：↑ 表示相對(duì)于對(duì)照組含量升高，↓ 表示相對(duì)于對(duì)照組含量降低。

Notes: ↑ indicates increasing content compared with the control group; ↓ indicates decreasing content compared with the control group.

2.2 受亞硝酸鹽脅迫的日本沼蝦肝胰腺中差異代謝物的鑒定及代謝通路分析

經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀、氣質(zhì)聯(lián)用儀分析檢測(cè)，篩選出實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間具有顯著差異性的代謝物(表1)，并進(jìn)行在線通路分析，結(jié)果顯示：這些差異性代謝物主要涉及氨基酸代謝、磷脂代謝、淀粉和蔗糖等的代謝；其中包含15條代謝通路，即苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成(impact=1)，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成(impact=0.666)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(impact=0.58)，甘油磷脂代謝(impact=0.231)，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，谷胱甘肽代謝，苯丙氨酸代謝，組氨酸代謝，β-丙氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，硫代謝，嘧啶代謝，嘌呤代謝，色氨酸代謝和酪氨酸代謝等。

2.3 氨對(duì)日本沼蝦肝胰腺代謝的影響

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后選擇了pH=9.0，TAN=1.0 mg·L-1的氨氮組，進(jìn)行了為期2、3和5 d的脅迫實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)主成分分析(PCA)后表明，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組TAN-2d 間的代謝物輪廓呈明顯的分離趨勢(shì)(圖4)，即對(duì)照組與氨氮(TAN-2d)組已產(chǎn)生顯著差異。故隨后選取(TAN-2d)組，對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(TAN-2d)進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，用OPLS-DA法進(jìn)一步分析肝胰腺的代謝數(shù)據(jù)(圖5和圖6)，表示模型解釋能力的參數(shù)RX2=0.814，表示模型預(yù)測(cè)能力的參數(shù)Q2=0.713，說(shuō)明模型可靠。由此可知，模型對(duì)自變量的擬合能力和預(yù)測(cè)能力良好，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組在肝胰腺代謝譜中均可以明顯區(qū)分。

2.4 受氨脅迫的日本沼蝦肝胰腺中差異代謝物的鑒定及代謝通路分析

經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀、氣質(zhì)聯(lián)用儀分析檢測(cè)，篩選出對(duì)照組與氨氮組間具有顯著差異性的代謝物(表2)并進(jìn)行在線通路分析。結(jié)果顯示，這些差異性代謝物主要涉及氨基酸代謝、磷脂代謝、淀粉和蔗糖等代謝；其中包含17條代謝通路，即苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成(impact=1)，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成(impact=0.670)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(impact=0.580)，甘油磷脂代謝(impact=0.231)，檸檬酸循環(huán)(impact=0.182)，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，甲烷代謝，谷胱甘肽代謝，苯丙氨酸代謝，組氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，硫代謝，色氨酸代謝，酪氨酸代謝和甘油磷脂代謝等。

2.5 氨脅迫對(duì)日本沼蝦檸檬酸循環(huán)的影響

在亞硝酸鹽與氨脅迫下，日本沼蝦肝胰腺中差異代謝物主要涉及氨基酸代謝、脂肪酸代謝、磷脂代謝和糖酵解等；在氨氮組與對(duì)照組有顯著性差異的化合物中發(fā)現(xiàn)了草酰乙酸、α-酮戊二酸等三羧酸循環(huán)的相關(guān)代謝物。氨中毒會(huì)導(dǎo)致三羧酸循環(huán)的中斷，阻礙能量供應(yīng)，造成水生生物的昏迷或死亡等[18]。因此，設(shè)計(jì)了pH=9.0、TAN為1.0 mg·L-1，脅迫時(shí)間分別為12、24和48 h的脅迫實(shí)驗(yàn)，采用氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)日本沼蝦肝胰腺中的草酰乙酸、檸檬酸、L-谷氨酸和α-酮戊二酸進(jìn)行定量測(cè)定。

草酰乙酸與乙酰-CoA縮合形成三羧酸循環(huán)通路中的草酰乙酸、檸檬酸含量見(jiàn)圖7，谷氨酸生成α-酮戊二酸通路中的谷氨酸、α-酮戊二酸含量見(jiàn)圖8。利用Graphpad prism7.0作圖，其中T檢驗(yàn)的P≤0.05表明具有顯著差異性。脅迫12 h時(shí)，日本沼蝦肝胰腺中草酰乙酸含量與對(duì)照組相比顯著升高，脅迫進(jìn)行24 h與48 h后其含量回落，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異；檸檬酸和谷氨酸含量與對(duì)照組相比，在12、24和48 h時(shí)差異均不顯著；α-酮戊二酸的含量在12 h時(shí)與對(duì)照組相比有一定的上升，脅迫進(jìn)行24 h及48 h后回落。

3 討論(Discussion)

亞硝酸鹽和氨是蝦類養(yǎng)殖中重要的環(huán)境污染因子，脅迫后可使甲殼類生物產(chǎn)生組織病變，其中對(duì)肝胰腺的影響最為嚴(yán)重[19]。研究表明，亞硝酸鹽和氨氮長(zhǎng)時(shí)間脅迫可使甲殼綱動(dòng)物的免疫力下降，肝胰腺組織結(jié)構(gòu)受到破壞[20]。鐘君偉等[21]對(duì)克氏原螯蝦進(jìn)行脅迫實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)高濃度的亞硝酸鹽致使肝胰腺中總超氧化物歧化酶(T-SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性降低，酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)活性在12 h時(shí)被激活，之后恢復(fù)到對(duì)照水平。李永等[22]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度氨氮脅迫下，斑節(jié)對(duì)蝦在實(shí)驗(yàn)前期生物免疫力增高，中后期機(jī)體生理失調(diào)，酶活力下降。本實(shí)驗(yàn)中，亞硝酸鹽及氨脅迫組與對(duì)照組相比，日本沼蝦肝胰腺中色氨酸含量升高，苯丙氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸的含量均降低，亞硝酸鹽和氨可能造成了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成與代謝的紊亂。亮氨酸是支鏈氨基酸(BCAA)中唯一的生酮氨基酸，纈氨酸屬于生糖氨基酸，可共同保護(hù)肌肉，對(duì)血紅蛋白合成及血糖水平調(diào)節(jié)有重要作用[23-25]，且具有促進(jìn)組織損傷修復(fù)等功能[26]。與對(duì)照組相比，亞硝酸鹽脅迫組與氨脅迫組亮氨酸的含量均降低，表明亞硝酸鹽與氨脅迫可能會(huì)抑制日本沼蝦肝胰腺血紅蛋白的合成及血糖調(diào)節(jié)。

通過(guò)Metabo Analyst 3.0通路分析，日本沼蝦肝胰腺中的甘油磷脂代謝涉及磷脂酸(PA)、磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)。其中磷脂酸具有活化細(xì)胞、維持新陳代謝、增強(qiáng)免疫力等功能，磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分，并且三者之間可相互轉(zhuǎn)化[27]。亞硝酸鹽與氨氮脅迫均能夠引起三者脂質(zhì)代謝紊亂，一旦出現(xiàn)紊亂易引起各種疾病的發(fā)生。與對(duì)照組相比氨氮脅迫組中鞘磷脂含量降低。鞘磷脂構(gòu)成的多層膜結(jié)構(gòu)對(duì)神經(jīng)纖維起保護(hù)和絕緣作用，可水解為神經(jīng)酰胺，在細(xì)胞膜上形成神經(jīng)酰胺的富集區(qū)，增加肝細(xì)胞對(duì)各種刺激的敏感性，影響肝細(xì)胞的增殖、存活及凋亡[28-29]。推測(cè)在氨氮脅迫下日本沼蝦肝胰腺細(xì)胞的增殖、存活及凋亡會(huì)受到一定影響。二?；视腿谆呓z氨酸(DGTS)為細(xì)胞膜無(wú)磷脂[30-31]，與對(duì)照組相比，0.5 mg·L-1亞硝酸鹽與氨氮(pH=9.0，TAN=1.0 mg·L-1)脅迫組日本沼蝦肝胰腺中DGTS含量均有所升高，表明其可能對(duì)肝胰腺細(xì)胞膜的組成產(chǎn)生影響。亞硝酸鹽脅迫組與對(duì)照組相比具有顯著差異性代謝物還包括：甘油二酯(DG)，屬于甘油酯，是動(dòng)物組織中的微量成分，在血淋巴系統(tǒng)和肝臟中可相互轉(zhuǎn)化，對(duì)于細(xì)胞膜具有一定的破壞作用[32-33]。亞硝酸鹽實(shí)驗(yàn)組中DG含量顯著升高，推測(cè)亞硝酸鹽可能會(huì)對(duì)日本沼蝦肝胰腺細(xì)胞膜造成影響。

表2 氨(TAN=1.0 mg·L-1，pH=9.0)脅迫組(2 d)與 對(duì)照組日本沼蝦肝胰腺代謝物中具有顯著差異的成分列表Table 2 Differential metabolites in Macrobrachium nipponensis hepatopancreas between ammonia (TAN=1.0 mg·L-1, pH=9.0, 2 d) exposure group and control group

注：↑ 表示相對(duì)于對(duì)照組含量升高，↓ 表示相對(duì)于對(duì)照組含量降低。

Notes: ↑ indicates increasing content compared with the control group; ↓ indicates decreasing content compared with the control group.

圖4 日本沼蝦經(jīng)氨氮(TAN=1.0 mg·L-1，pH=9.0)脅迫后肝胰腺的代謝化合物主成分(PCA)得分圖注：C代表對(duì)照組，TAN-5代表氨氮(TAN=1.0 mg·L-1，pH=9.0)脅迫5 d的實(shí)驗(yàn)組，TAN-3代表氨氮(TAN=1.0 mg·L-1，pH=9.0)脅迫3 d的實(shí)驗(yàn)組， TAN-2代表氨氮(TAN=1.0 mg·L-1，pH=9.0)脅迫2 d的實(shí)驗(yàn)組，TAN-5-x、TAN-3-x和TAN-2-x代表各組內(nèi)的平行樣本，即第1至第6尾蝦。Fig. 4 PCA score plots of metabolites in Macrobrachium nipponensis hepatopancreas in control group and experimental groups exposed to ammonia (TAN=1.0 mg·L-1, pH=9.0) Note: C is control group; TAN-5 is experimental group exposed to ammonia (TAN=1.0 mg·L-1, pH=9.0) for 5 d; TAN-3 is experimental group exposed to ammonia (TAN=1.0 mg·L-1, pH=9.0) for 3 d; TAN-2 is experimental group exposed to ammonia (TAN=1.0 mg·L-1, pH=9.0) for 2 d; TAN-5-x, TAN-3-x and TAN-2-x is a parallel sample of each group, from the frist shrimp to the sixth.

圖5 日本沼蝦經(jīng)氨氮(TAN=1.0 mg·L-1，pH=9.0)脅迫2 d后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組肝胰腺代謝 化合物的正交偏最小二乘法(OPLS-DA)得分圖注：C代表對(duì)照組，TAN代表氨氮(TAN=1.0 mg·L-1，pH=9.0)脅迫2 d的實(shí)驗(yàn)組，TAN-x代表實(shí)驗(yàn)組內(nèi)的平行樣本，即第1至第6尾蝦。Fig. 5 OPLS-DA score plots of metabolites in Macrobrachium nipponensis hepatopancreas in control group and experimental groups exposed to ammonia (TAN=1.0 mg·L-1, pH=9.0) for 2 d Note: C is control group; TAN is experimental group exposed to ammonia (TAN=1.0 mg·L-1, pH=9.0) for 2 d; TAN-x is a parallel sample of each group, from the frist shrimp to the sixth.

圖6 OPLS-DA得分圖(圖5)的交互驗(yàn)證圖注：R2表示累計(jì)方差值，Q2表示累計(jì)交叉有效性。Fig. 6 Permutation test of OPLS-DA score plots (figure 5) Note:R2 stands for cumulative variance; Q2 stands for cumulative cross validity.

圖7 對(duì)照組與氨脅迫組(pH=9.0，TAN=1.0 mg·L-1)12、24和48 h時(shí)日本沼蝦肝胰腺中草酰乙酸和檸檬酸含量的變化Fig. 7 The changes in the contents of oxalacetic acid and citric acid in Macrobrachium nipponensis hepatopancreas at 12, 24 and 48 h in control group and experimental group (pH=9.0, TAN=1.0 mg·L-1)

圖8 對(duì)照組與氨脅迫組(pH=9.0，TAN=1.0 mg·L-1)12、24、48 h時(shí)日本沼蝦肝胰腺中谷氨酸、α-酮戊二酸含量的變化Fig. 8 The changes in the contents of glutamic acid and α-ketoglutarate in Macrobrachium nipponensis hepatopancreas at 12, 24 and 48 h in control group and experimental group (pH=9.0, TAN=1.0 mg·L-1)

草酰乙酸與乙酰輔酶A在檸檬酸合酶(citrate synthase, CS)的催化作用下縮合形成檸檬酸，其中檸檬酸合酶屬于調(diào)控酶，也是三羧酸循環(huán)中第一關(guān)鍵酶，是細(xì)胞內(nèi)多種代謝途徑的關(guān)鍵限速酶及代謝變化的標(biāo)志物，CS具有高度的底物特異性，僅催化乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合成檸檬酸，并且CS的活性強(qiáng)弱直接關(guān)系到檸檬酸的合成[34-37]。對(duì)pH=9.0，TAN=1.0 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，對(duì)三羧酸循環(huán)中草酰乙酸、檸檬酸、谷氨酸和α-酮戊二酸進(jìn)行定量測(cè)定，脅迫12 h的日本沼蝦肝胰腺中草酰乙酸含量與對(duì)照組相比有顯著上升，而產(chǎn)物中的檸檬酸含量變化不明顯，可能氨脅迫使檸檬酸合酶的活性降低，抑制了產(chǎn)物中檸檬酸形成，從而使得作為底物的草酰乙酸含量得以積累，而合成的檸檬酸含量則未見(jiàn)增加。脅迫24 h和48 h時(shí)，日本沼蝦體內(nèi)的草酰乙酸含量與對(duì)照組差異不顯著，推測(cè)在較長(zhǎng)時(shí)間脅迫下蝦體產(chǎn)生了適應(yīng)性，并且有恢復(fù)的可能。α-酮戊二酸(α-KG)是一種重要的短鏈羥酸，是三羧酸循環(huán)重要的代謝中間產(chǎn)物[38]，α-KG可通過(guò)轉(zhuǎn)氨基形成谷氨酸從而連接細(xì)胞內(nèi)碳-氮代謝，可直接參與集體的氧化供能及生物體內(nèi)多種物質(zhì)的化學(xué)合成[39-40]。在pH=9.0，TAN=1.0 mg·L-1條件下脅迫12、24和48 h后，日本沼蝦肝胰腺內(nèi)α-KG含量在脅迫12 h時(shí)有小幅度升高，可能在氨的脅迫作用下日本沼蝦產(chǎn)生了短暫的應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所示：亞硝酸鹽(0.5 mg·L-1)脅迫下，鑒定出49個(gè)與對(duì)照組相比具有顯著差異的代謝化合物，亞硝酸鹽會(huì)導(dǎo)致日本沼蝦氨基酸代謝、脂肪酸代謝和甘油磷脂代謝紊亂。pH=9.0時(shí)，TAN(1.0 mg·L-1)脅迫后，鑒定出顯著差異性代謝化合物52個(gè)，氨脅迫12 h會(huì)造成檸檬酸循環(huán)中的草酰乙酸與α-酮戊二酸的含量升高，氨會(huì)影響日本沼蝦的三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝、脂肪酸代謝和甘油磷脂代謝。后續(xù)可對(duì)氨氮脅迫下日本沼蝦肝胰腺中的蘋(píng)果酸脫氫酶及檸檬酸合酶的變化、以及磷脂代謝所受影響等作進(jìn)一步驗(yàn)證，從代謝組學(xué)層面為氨對(duì)日本沼蝦肝胰腺的毒性機(jī)制補(bǔ)充信息。