張超越，楊艷鴻，薛雨欣，吳 敏，蓋立萍，李海剛，王守箐，劉 林

（臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東 臨沂 276005）

植物葉綠體白天進(jìn)行光合作用，光合產(chǎn)物不 能及時(shí)運(yùn)出時(shí)就轉(zhuǎn)化為淀粉，以作暫時(shí)貯藏，夜間淀粉降解，降解產(chǎn)物再以蔗糖形式轉(zhuǎn)運(yùn)出葉肉細(xì)胞，進(jìn)入維管束，裝載到韌皮部篩管，向植株其他生長(zhǎng)部位運(yùn)輸，因而白天積累淀粉是葉綠體的一個(gè)典型特征[1-5]。韭菜是栽培廣泛的葉類蔬菜作物，為了解韭菜葉的光合產(chǎn)物積累特征，本研究用組織化學(xué)和透射電子顯微技術(shù)對(duì)韭菜葉綠體進(jìn)行了分析。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017—2018年在臨沂大學(xué)藥用植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

供試韭菜品種為“壽光馬藺韭”，購(gòu)于臨沂種子公司；供試西瓜品種為“京欣”，購(gòu)于臨沂市種子公司。

1.3 試驗(yàn)儀器及藥品

儀器：JEOL 1220電子顯微鏡，奧林巴斯光學(xué)顯微鏡，Ultracut R切片機(jī)。

藥品：Embed-812樹(shù)脂，固定劑為四氧化鋨，脂染色劑為戊二醛，電子染色劑為檸檬酸鉛和醋酸鈾。

1.4 試驗(yàn)方法

以西瓜葉作為淀粉檢測(cè)對(duì)照，鑒定韭菜葉中的淀粉。韭菜于4月上旬育苗，6月下旬定植到大田，翌年5月取樣。西瓜于3月初播種于營(yíng)養(yǎng)缽，4月移栽于大田?？紤]到葉綠體白天進(jìn)行光合作用、合成淀粉[2,4]，選擇晴朗天11：00取韭菜和西瓜植株新鮮幼葉和成熟葉進(jìn)行淀粉鑒定和葉綠體超微特征分析。

1.4.1 淀粉組織化學(xué)鑒定方法

碘法[6]：樣品切成0.5 mm×0.5 mm小片，用2%戊二醛固定液（0.05 mol/L磷酸緩沖液配制，pH值 6.8）固定3 h，用1%四氧化鋨固定2 h，用碘-碘化鉀溶液染色2 h，然后脫水、樹(shù)脂包埋、切片，切片用苯胺藍(lán)復(fù)染，顯微鏡下如有淀粉則顯示藍(lán)色，同時(shí)也顯示出細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

錫夫試劑法[7]：樣品切成0.5 mm×0.5 mm小片，用2%戊二醛固定液固定3 h，用1%四氧化鋨固定2 h，洗滌后在0.5%高碘酸（0.3%硝酸配制）中浸1 h，自來(lái)水洗5 min，錫夫試劑中3 h，用偏亞硫酸氫鈉溶液洗滌3次，每次5 min，自來(lái)水洗20 min，然后脫水、樹(shù)脂包埋、切片，厚度1.0～1.5 μm，顯微鏡下觀察，如有淀粉存在則會(huì)呈現(xiàn)為紅色顆粒。切片經(jīng)苯胺藍(lán)染色，則在顯示淀粉的同時(shí)也顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.4.2 透射電子顯微技術(shù)

從大田韭菜和西瓜植株上分別剪下幼葉和成熟葉的部分葉片，浸入2%戊二醛固定液，回到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)切去受損傷的邊緣，修成小于 1 mm×1 mm小塊，再放入2%戊二醛固定液，固定4 h。樣品用緩沖液洗滌3次，再用1%四氧化鋨溶液固定4 h。樣品用梯度酒精脫水，以丙酮置換酒精，包埋于Embed-812樹(shù)脂中。包埋塊用鉆石刀切片，切片厚度60 nm，用5%醋酸鈾染色20 min，再用0.1%檸檬酸鉛染色2 min，JEOL1220透射電子顯微鏡下觀察韭菜和西瓜葉肉細(xì)胞、表皮細(xì)胞和維管組織細(xì)胞中的葉綠體和淀粉。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉鑒定結(jié)果

2.1.1 組織化學(xué)鑒定結(jié)果

如表1所示，用碘-碘化鉀和錫夫試劑檢測(cè)淀粉，韭菜幼葉和成熟葉都呈陰性反應(yīng)，表明不含淀粉；經(jīng)錫夫試劑和苯胺藍(lán)染色后，葉肉細(xì)胞葉綠體染色深且均勻（圖1 A），表明葉綠體內(nèi)蛋白質(zhì)豐富，但不含淀粉。同樣用碘-碘化鉀和錫夫試劑檢測(cè)，西瓜幼葉和成熟葉都呈陽(yáng)性反應(yīng)，顯示含有淀粉。用錫夫試劑和苯胺藍(lán)染色后，葉綠體著色不均勻，淀粉粒著色較深，葉綠體其他區(qū)域染色較淺（圖1 B）。

2.1.2 電子顯微鏡鑒定結(jié)果

電鏡下觀察，如表2所示，韭菜成熟葉和幼葉葉肉細(xì)胞中的葉綠體（圖1 C）、維管薄壁細(xì)胞中的質(zhì)體（圖1 F）和表皮細(xì)胞中的質(zhì)體（圖1 G）都沒(méi)有積累淀粉。與韭菜葉綠體形成鮮明對(duì)比，西瓜不僅幼葉和成熟葉葉肉細(xì)胞的葉綠體含有淀粉（圖1 H），而且維管薄壁細(xì)胞中的質(zhì)體（圖1 I）和表皮細(xì)胞中的質(zhì)體（圖1 J）也含有淀粉。

2.2 韭菜葉綠體的超微特征

韭菜葉綠體呈橢球形，大小約3 μm×5 μm，含大量類囊體，類囊體構(gòu)成大量基粒，每個(gè)基粒都含有很多平行堆疊的類囊體（圖1 C—E）。在生長(zhǎng)旺盛的幼葉片內(nèi)，類囊體膜電子染色較淺，比基質(zhì)著色能力弱，因此呈現(xiàn)負(fù)染色（圖1 C、D）；在成熟葉片內(nèi)，類囊體膜染色較深，比基質(zhì)著色能力強(qiáng)（圖1 E）。葉綠體含質(zhì)體小球（質(zhì)體內(nèi)的脂滴），小球電子染色較淺。

表1 淀粉組織化學(xué)鑒定結(jié)果

表2 淀粉的電鏡觀察結(jié)果

維管薄壁細(xì)胞以輔助光合產(chǎn)物運(yùn)輸和向韌皮部裝載為主要功能，這些細(xì)胞含有體積很小的質(zhì)體，呈棒狀，大小約0.4 μm×1.2 μm，含少量類囊體，缺少典型基粒，顯然沒(méi)有分化成葉綠體（圖1 F），屬于原質(zhì)體。以保護(hù)為功能的表皮細(xì)胞中的質(zhì)體也很小，也呈棒狀，約為0.4 μm×1.2 μm，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，沒(méi)有分化成葉綠體，仍屬于原質(zhì)體。

3 結(jié)論與討論

組織化學(xué)和電鏡技術(shù)研究結(jié)果表明，韭菜幼葉和成熟葉葉肉細(xì)胞中的葉綠體不含淀粉，以輔助光合產(chǎn)物運(yùn)輸并向韌皮部篩管裝載為主要功能的維管薄壁細(xì)胞及以保護(hù)為功能的表皮細(xì)胞中未分化成葉綠體的質(zhì)體也不積累淀粉。而用同樣方法檢測(cè)，西瓜幼葉和成熟葉不僅葉肉細(xì)胞中的葉綠體含有淀粉，維管組織和表皮中沒(méi)有分化成葉綠體的質(zhì)體也含有淀粉。顯然，韭菜葉綠體沒(méi)有合成淀粉的能力，這是韭菜葉綠體的一個(gè)突出細(xì)胞生物學(xué)特征。此外，韭菜幼葉和成熟葉葉綠體的類囊體膜電子染色能力不同，幼葉類囊體膜電子染色深，成熟葉類囊體膜染色淺，這是韭菜葉綠體的另一個(gè)細(xì)胞生物學(xué)特征。

在韭菜葉中檢測(cè)不到淀粉，洋蔥和大蒜葉中也沒(méi)有檢測(cè)到淀粉[8]，因此不積累淀粉可能是蔥屬植物的一個(gè)共同特征，但這一推測(cè)尚需要對(duì)更多其他蔥屬植物進(jìn)行研究。

韭菜葉表皮和維管薄壁細(xì)胞中的原質(zhì)體不積累淀粉，一個(gè)有趣的問(wèn)題是根冠細(xì)胞中的質(zhì)體是否含有淀粉。根冠細(xì)胞中的淀粉體在根對(duì)重力信號(hào)感受過(guò)程中起重要作用，是維持根向地性所不可缺少的，根冠失去淀粉，根就失去向地性[9]。如果韭菜根冠細(xì)胞中不含淀粉，那么韭菜根感受重力的機(jī)制就與其他植物不同。

圖1 韭菜與西瓜葉片顯微與超微圖片

不同發(fā)育階段類囊體膜的著色能力有顯著差異，這是由膜蛋白的多少引起的，膜蛋白越多，膜的著色能力越強(qiáng)。在葉片旺盛生長(zhǎng)階段，類囊體膜系統(tǒng)正處在快速建立階段，膜結(jié)合蛋白較少，因此膜著色能力較弱。而在成熟葉片內(nèi)，類囊體膜上的光合系統(tǒng)業(yè)已建立，類囊體膜結(jié)合蛋白多，所以著色能力較強(qiáng)。膜蛋白主要是參與構(gòu)成光合作用裝置的蛋白質(zhì)，如光合電子傳遞鏈、ATP合酶等。因此，類囊體膜電子染色深意味著葉綠體光合作用能力較強(qiáng)，染色淺則意味著光合能力較弱。