許昌超，鄭富海，李 鋌，葉少萍，張俊濤

(廣州市林業(yè)和園林科學研究院，廣東 廣州 510405)

在中國南方地區(qū)，紅壤是比較常見的土壤類型，研究表明，因紅壤獨特的理化性質(zhì)導致紅壤更容易缺乏有效磷，進而造成植物營養(yǎng)性缺磷，磷元素已成為南方農(nóng)林生產(chǎn)過程中重要的養(yǎng)分限制因子[1-2].為了滿足植物生長對磷元素的需求，大量使用含磷化肥導致土壤環(huán)境問題加劇，同時造成水體嚴重的富營養(yǎng)化[3].此外，由于磷富礦資源的大量消耗，我國國土資源部已把磷礦列為2010年后不能滿足國民經(jīng)濟發(fā)展需要的20種礦產(chǎn)之一[4].因此，研究如何提高土壤環(huán)境中磷元素利用效率問題具有迫切的實際意義.

土壤微生物的代謝活動對土壤的理化環(huán)境和土壤肥力具有很大的影響，研究表明土壤中存在為數(shù)不少的能夠溶解難溶性磷酸鹽的微生物，這些微生物被統(tǒng)稱為溶磷微生物[5].已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的具有溶磷能力的微生物包括真菌、放線菌以及細菌，利用微生物來提高土壤中有效磷的含量對解決植物生長缺磷問題具有重要意義[6].目前，已經(jīng)有相當一部分含有溶磷微生物的菌肥在玉米、水稻等種植過程中得到應(yīng)用，并獲得預(yù)期的效果，展現(xiàn)了良好的開發(fā)和應(yīng)用前景[7-8].筆者擬從南方典型紅壤中篩選出具有優(yōu)良溶磷效果的菌株，初步對其溶磷特性展開研究，為利用溶磷菌提高土壤中有效磷的含量提供一些科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試土壤：廣州市番禺區(qū)典型林地紅壤.3個取樣點分別是喬木、灌木和草坪植物的根際土壤樣品，標記為JL1、JL2和JL3，每種樣品3個重復，JL1、JL2和JL3是3個重復的混樣.

試劑材料：無機磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基[9]、可替換無機磷源(AlPO4、Ca3(PO4)2或磷礦粉)、可替換碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉或纖維素)、富集培養(yǎng)基[10]、真菌DNA提取試劑盒(OMEGA)、HPLC標準品(乙酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、丙二酸、葡萄糖酸、酒石酸和乳酸，標準品，均購自Sigma-Aldrich).

1.2 實驗方法

1.2.1 初篩及復篩

取3 g供試土壤樣品，在無菌條件下研磨成粉狀，加入50 mL富集培養(yǎng)基中，隔夜培養(yǎng).取適量富集培養(yǎng)基按照10-2，10-3，10-4，10-5進行梯度稀釋至1 mL，取0.1 mL稀釋液涂布于無機磷篩選培養(yǎng)平板上，每個梯度3個重復.27 ℃條件下(經(jīng)實驗獲得的適宜生長溫度)培養(yǎng)3～7 d，挑取周圍具有明顯溶磷圈的菌落，分別重新接種于無機磷篩選培養(yǎng)平板上并劃線，直至出現(xiàn)明顯的單菌落.

1.2.2 固體平板上溶磷能力測定

挑取菌株，接種于固體篩選平板上，27 ℃條件下培養(yǎng)，測定溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d)，通過二者比值(D/d)初步確定對應(yīng)菌株的溶磷能力[11].

1.2.3 菌株的分子遺傳學鑒定

將M1接種于5 mL的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，提取基因組.擴增的通用引物為ITS1 (5′TCCGTAGCT GAACCTGCGG3′) 以及ITS4 (5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′)[12].優(yōu)化后的PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，32循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存.PCR反應(yīng)體系：2 × PCR預(yù)混液25 μL、上游引物1.5 μL、下游引物1.5 μL、模版2 μL，補水至50 μL.使用1%瓊脂糖凝膠純化并回收PCR產(chǎn)物，測序并分析，利用MEGA 5.0進行系統(tǒng)發(fā)育樹的建立.

1.2.4 液體培養(yǎng)條件下解磷能力測定

從平板上分別挑取單菌落接種于3 mL無機磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基，27 ℃培養(yǎng)2 d.取1 mL菌液按1∶100體積比接種于500 mL搖瓶中(含100 mL無機磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，設(shè)置接種1 mL無菌無機磷培養(yǎng)基作為對照.連續(xù)培養(yǎng)7 d，每天取樣，離心收集上清液，利用鉬藍比色法測定有效磷含量，并記錄對應(yīng)pH，重復3次.

為了檢測M1對不同無機磷源的溶解能力，將M1分別接種到以AlPO4、Ca3(PO4)2或磷礦粉為無機磷源的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)[9].培養(yǎng)和數(shù)據(jù)監(jiān)測如上.

為了研究碳源對菌株溶磷能力影響，以葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉以及纖維素分別單獨作為無機磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源來培養(yǎng)菌株M1[13].培養(yǎng)和數(shù)據(jù)監(jiān)測如上.

1.2.5 有機酸種類及含量測定

取發(fā)酵液樣品進行高速離心后，取上清經(jīng)過濾、除鹽、稀釋等處理，用高效液相色譜儀(島津，LC-20A)對發(fā)酵液中有機酸成分進行分析.色譜條件：色譜柱Suprsil C18，250 mm×4.6 mm，5 μm；檢測波長214 nm；流動相為25 mmol·L-1KH2PO4水溶液，用磷酸調(diào)pH至2.5；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃.

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0軟件對培養(yǎng)基pH和溶磷量進行Pearson相關(guān)性分析；各項指標測定結(jié)果表示為平均值±標準差；相關(guān)圖表用Excel 2007制作.

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷微生物的篩選

土壤微生物在部分無機磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上的生長情況如圖1所示，其中，樣品JL2、JL3對應(yīng)的平板上均觀察到明顯的溶磷斑塊(圖1中黑色箭頭所示)，CK為涂布等量無菌水的陰性對照.對JL2平板上的溶磷菌株進行了純化和傳代培養(yǎng)驗證(圖2所示)，證明了菌株的純度和溶磷能力的遺傳穩(wěn)定性.由圖2可以看出，該菌株為絲狀真菌，培養(yǎng)基質(zhì)中的菌絲為乳白色，氣生菌絲為灰黑色(顏色隨著成熟程度加深)，初步判定為黑曲霉(簡寫M1)，菌落周圍可觀察到透明溶磷斑塊.其27 ℃條件下培養(yǎng)4 d后溶磷圈直徑(D=(46.4±5.17) mm)和菌落直徑(d=(26.8±2.28) mm)對比最為明顯，D/d可達1.73.

圖1 采樣點對應(yīng)的土壤微生物在部分無機磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基上溶磷斑的鑒定

從第2列到第5列為傳代過程，圖示為依次傳代后第7天的生長狀況.圖2 解磷霉菌M1的純化

2.2 菌株M1的分子生物學鑒定

霉菌M1的ITS序列PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示該序列長度為600 bp左右.利用MEGA 5.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，M1與黑曲霉Aspergillusniger的ITS序列同源性達99%.

圖3 M1基于ITS序列差異的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

2.3 M1對不同磷源的溶磷能力測定

圖4為M1對不同磷源的溶磷結(jié)果.

圖4 菌株M1的溶磷能力鑒定

圖4顯示，在以Ca3(PO4)2為磷源的液體環(huán)境下，培養(yǎng)5 d后，溶液中有效磷含量達到峰值為75.4 mg·L-1(圖4(a))；在以AlPO4為磷源的液體環(huán)境下，培養(yǎng)6 d后，溶液中有效磷含量達到峰值為138.3 mg·L-1(圖4(b))；在以磷礦粉為磷源的液體環(huán)境下，培養(yǎng)5 d后，溶液中有效磷含量達到峰值為82.4 mg·L-1(圖4(c))，存在一定差異.綜合圖4的趨勢來看，隨著M1培養(yǎng)液pH的降低，溶液中可溶性磷的含量升高.對培養(yǎng)液pH與溶磷值的相關(guān)性進行了分析，表明M1對Ca3(PO4)2、AlPO4以及磷礦粉的溶解能力與對應(yīng)發(fā)酵液的pH均具有顯著負相關(guān)性(p≤0.01).

2.4 碳源種類對M1溶解磷礦粉的能力影響

不同碳源培養(yǎng)下M1溶解磷礦粉的結(jié)果列于表1.

表1 M1在6種碳源培養(yǎng)條件下的溶磷量與對應(yīng)的pH和菌體質(zhì)量

由表1可知，在以麥芽糖和蔗糖為碳源時，M1的溶磷峰值分別可達161.0 mg·L-1和147.2 mg·L-1，較以葡萄糖為碳源條件下的溶磷峰值(82.4 mg·L-1)提升了約兩倍；果糖培養(yǎng)條件下，溶磷峰值(57.4 mg·L-1)低于葡萄糖；在以淀粉為碳源的培養(yǎng)條件下，M1的溶磷峰值(4.8 mg·L-1)大幅降低，纖維素作為碳源時，溶磷能力(2.7 mg·L-1)最低.從數(shù)值上來看，發(fā)酵液的pH與溶磷量也存在一定的關(guān)聯(lián).對菌體質(zhì)量的研究結(jié)果表明，在以葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖為碳源培養(yǎng)條件下，M1可以正常生長，但是M1很難利用淀粉和纖維素進行增殖.

2.5 HPLC測定結(jié)果

對有機酸標準品與M1發(fā)酵液的HPLC分析測試結(jié)果如圖5、6所示.

圖5 8種小分子有機酸混合標準品色譜圖

圖6 發(fā)酵樣品色譜圖

由圖5、6通過比對發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中確實含有有機酸成分，主要包括蘋果酸、乳酸、乙酸和檸檬酸.

在以Ca3(PO4)2為無機磷源條件下，連續(xù)培養(yǎng)7 d，對4種有機酸的總量和溶磷能力之間的相關(guān)性進行分析.分析結(jié)果如表2所示，M1的溶磷能力和蘋果酸、乳酸、乙酸以及總有機酸含量的相關(guān)性不顯著，但與檸檬酸的含量之間存在顯著相關(guān)關(guān)系(p≤0.01).

表2 M1發(fā)酵液中有機酸含量與溶磷量之間的相關(guān)性

注：**代表顯著相關(guān)(n=21,p≤0.01).

3 結(jié)論與討論

液體培 養(yǎng)實驗表明M1對Ca3(PO4)2、AlPO4以及磷礦粉均具有較高的溶解能力，溶解能力表現(xiàn)為AlPO4> Ca3(PO4)2和磷礦粉(圖4)，對AlPO4具有一定的偏好性.已有研究表明，同一株解磷微生物對不同的難溶性無機磷酸鹽的溶解能力存在差異[14].目前，一般認為真菌溶磷的能力主要與其向培養(yǎng)基中分泌的小分子有機酸有關(guān).分泌有機酸一方面可以降低培養(yǎng)基pH，利于難溶性磷酸鹽的溶解；另一方面可以通過結(jié)合鐵、鎂、鈣、鋁等離子將磷酸鹽釋放出來[15-16].因此，造成M1對不同無機磷源溶解能力的差異可能與M1分泌的有機酸對不同金屬離子的螯合能力存在差異有關(guān).

在實驗中添加了3種無機磷源的培養(yǎng)液在接種M1之后，培養(yǎng)液的pH較對照均有明顯的下降趨勢，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，M1對AlPO4、磷礦粉以及Ca3(PO4)2的溶磷能力與發(fā)酵液的pH存在顯著的負相關(guān)關(guān)系(p≤0.01)，這一結(jié)果反映出溶磷量與發(fā)酵液pH在數(shù)值上的相關(guān)性，至于二者是否存在機制上的因果或其他關(guān)系，還有待于從分子遺傳學角度進一步驗證，如Goldstein等[17]將細菌Erwiniaherbicola中一段與吡咯喹啉醌(PQQ)合成相關(guān)的序列導入E.coliHB101中，使其能夠產(chǎn)生葡萄糖醛酸(GA)，從而獲得了解磷能力；Miller等[18]通過轉(zhuǎn)座子隨機插入的方式構(gòu)建了解磷菌PseudomonasfluorescensF113突變體庫，對解磷能力顯著下降的突變體分析發(fā)現(xiàn)，大部分插入突變都發(fā)生在葡萄糖脫氫酶(GDH)和PQQ合成基因上，這些結(jié)論說明了葡萄糖醛酸的分泌與若干菌株的解磷能力直接相關(guān)，未來的工作可以朝著這一方向開展.

筆者在研究中還發(fā)現(xiàn)M1在不同碳源的培養(yǎng)條件下，對磷礦粉的溶解能力表現(xiàn)為麥芽糖>蔗糖>葡萄糖>果糖>淀粉>纖維素.其中，以葡萄糖為碳源有利于菌體生長, 利用麥芽糖和蔗糖作為碳源可以顯著提高M1的溶磷能力，淀粉和纖維素不適宜M1的增殖和溶磷，這些結(jié)果具有一定的發(fā)酵和生產(chǎn)意義.未來可以根據(jù)實際需求來選擇碳源的種類.同時，從數(shù)值上來看，對應(yīng)的6種碳源的發(fā)酵液pH越低，發(fā)酵液溶磷量也越高，這一現(xiàn)象說明碳源可能通過影響有機酸的分泌來改變菌株的溶磷能力.

發(fā)酵液的HPLC分析結(jié)果表明發(fā)酵液中含有蘋果酸、乳酸、乙酸和檸檬酸，顯著性分析表明M1的溶磷量和乳酸、乙酸、蘋果酸和總有機酸含量之間關(guān)系不顯著，和檸檬酸含量顯著相關(guān)，這可能和不同有機酸與金屬離子的螯合能力不同或者有機酸的含量有關(guān).余文煜等[19-21]通過研究發(fā)現(xiàn)小分子有機酸或有機酸鹽可以作用于Ca3(PO4)2、AlPO4等無機磷源來提高土壤有效磷含量，并且不同有機酸或有機酸鹽之間的能力存在差異.目前，也有研究表明有些溶磷菌的溶磷能力與其分泌的有機酸含量和pH并無明顯相關(guān)性，推測可能存在其他復雜的溶磷機制[22-23].