王愛麗，商書波，孫夢瑤，王芳

德州學(xué)院山東省功能材料與配位化學(xué)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，德州 253023

鄰苯二甲酸酯(PAEs)，又名酞酸酯，是一種典型的內(nèi)分泌干擾物，部分PAEs已被美國環(huán)保署(EPA)和我國列為優(yōu)先監(jiān)測污染物[1]。PAEs作為塑料增塑劑，被廣泛應(yīng)用在地膜中，由于PAEs并未聚合到塑料的基質(zhì)中，因此農(nóng)田土壤中有PAEs檢出，其含量已達(dá)到幾十mg·kg-1[1-3]。國內(nèi)外學(xué)者對PAEs的削減研究主要集中在植物修復(fù)[4-6]、微生物降解[7-9]以及植物微生物聯(lián)合修復(fù)[10]等方面。

近年來，隨著蔬菜消費(fèi)需求的不斷增加，地膜覆蓋技術(shù)已廣泛應(yīng)用到蔬菜的種植中[11]。研究發(fā)現(xiàn)，被PAEs污染的土壤中種植蔬菜后，許多蔬菜如冬瓜、花椰菜、辣椒、菠菜、萵苣、花生和蘿卜等[12-14]可吸收并累積PAEs，且蔬菜中累積的PAEs濃度與土壤中PAEs的污染濃度成正比。馮艷紅等[15]在江蘇省設(shè)施菜地采集的50個(gè)蔬菜樣品中PAEs含量為38.31～241.87 μg·kg-1，檢出率為100%。陳佳祎等[2]采集北京市昌平區(qū)、延慶區(qū)和順義區(qū)的8個(gè)典型設(shè)施蔬菜基地的16份蔬菜樣品，測定出PAEs濃度為0.15～6.94 mg·kg-1。研究表明，長期食用被PAEs污染的蔬菜會(huì)干擾血液中激素的正常水平，如果超過美國EPA規(guī)定的1.2 mg·d-1的攝入量標(biāo)準(zhǔn)(體重60 kg)[16]，會(huì)存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。

番茄是我國栽培最為普遍的果菜之一，在蔬菜供應(yīng)中占有重要的地位。關(guān)于番茄種植過程中番茄對PAEs吸收累積方面的報(bào)道較少，為了明確番茄種植過程中番茄對土壤中PAEs的吸收累積及PAEs在土壤中的削減特征，本研究選擇2種污染程度最廣泛的PAEs：鄰苯二甲酸正丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸異辛酯(DEHP)作為研究對象，采用盆栽實(shí)驗(yàn)研究番茄種植過程中番茄植株及果實(shí)對土壤中DBP和DEHP的吸收累積特征及土壤中DBP和DEHP的削減特征，并計(jì)算生物富集因子，以期發(fā)現(xiàn)PAEs在番茄中的累積規(guī)律以及在土壤中的削減規(guī)律，為PAEs污染土壤的農(nóng)作物栽培以及植物修復(fù)提供理論依據(jù)，為消費(fèi)者的膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評估提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

(1)土壤

土壤采自德州市郊區(qū)農(nóng)田，風(fēng)干后過2 mm篩，理化性質(zhì)：pH值為7.5，有機(jī)質(zhì)為14.5 g·kg-1，堿解氮為70.6 mg·kg-1，速效磷為90.7 mg·kg-1，速效鉀為424.5 mg·kg-1。

(2)番茄苗

無菌番茄苗：將番茄種子先用蒸餾水浸泡，再用75%酒精浸泡，5%次氯酸鈉消毒，最后用蒸餾水清洗多次，在滅菌的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

未滅菌番茄苗：番茄種子用水浸泡后播種在泥炭土中。

1.2 儀器與試劑

儀器：HR40-IIA2超凈工作臺(tái)(中國Haier公司)；TG16G型臺(tái)式高速離心機(jī)(江蘇省鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；6890N/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司)。

試劑：DBP、DEHP，優(yōu)級純，購于美國Sigma Aldrich公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)番茄對DBP和DEHP的耐受程度以及現(xiàn)場調(diào)查蔬菜大棚土壤PAEs的污染水平，對盆栽實(shí)驗(yàn)中DBP和DEHP的添加量設(shè)計(jì)了低(10 mg·kg-1)、中(20 mg·kg-1)和高(50 mg·kg-1)3個(gè)污染水平。為了研究番茄對土壤中PAEs的吸收累積特征及微生物對番茄吸收累積PAEs的影響，盆栽實(shí)驗(yàn)采用4種處理方式：①滅菌土壤；②滅菌土壤+無菌番茄苗；③未滅菌土壤；④未滅菌土壤+未滅菌番茄苗。每種處理方式設(shè)3個(gè)重復(fù)，共36盆。

1.4 盆栽實(shí)驗(yàn)

土壤粒徑的測定參考Chaudhari等[17]的方法，測定出砂粒、粉粒和粘粒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為49.4%、37.1%和13.5%。

污染土壤的制備：用500 mL濃度為2 000 mg·L-1的DBP和DEHP甲醇溶液先染毒一部分土壤(約10 kg，占實(shí)驗(yàn)所用土量的10%)，待甲醇揮發(fā)完全后，將此染毒土壤與其余未染毒部分(約90 kg)混合，為確保混合均勻，將土壤再次過2 mm篩，得到染毒濃度為10 mg·kg-1的污染土壤。濃度為20 mg·kg-1和50 mg·kg-1污染土壤按照上述方法制備。

上述3個(gè)濃度的污染土壤用蒸餾水調(diào)節(jié)至田間持水量，作為盆栽實(shí)驗(yàn)用土。穩(wěn)定7 d后測得DBP和DEHP的初始濃度見表1。取其中一部分土壤采用高壓蒸汽滅菌法(121 ℃，20 min×3次)進(jìn)行滅菌處理，作為滅菌土壤。

盆栽實(shí)驗(yàn)于2016年5月上旬至11月下旬在德州學(xué)院玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)用瓷盆底部內(nèi)徑為20.0 cm、上部內(nèi)徑為27.0 cm、高為17.0 cm，每盆定植番茄苗一株。種植期間進(jìn)行田間常規(guī)管理，保證自然光照和充足水分，11月24日收集供試番茄根、地上部分(莖、葉)和果實(shí)樣品。采樣時(shí)，先用剪刀將番茄莖葉從土表處剪斷，然后將盆倒扣，采用抖根法分別獲得番茄根和根際土。

1.5 樣品預(yù)處理及PAEs測定

番茄植株預(yù)處理：取20.0 g番茄植株(濕重)于高速組織搗碎機(jī)中打碎，稱取2.0 g打碎樣品，放入組織研磨器，加入5 mL CH2Cl2，研磨5 min。將番茄植株勻漿移至離心管中，4 500 r·min-1離心5 min，先去掉上層水相，然后用膠頭滴管吸取CH2Cl2層到K-D濃縮器中，在N2吹脫下濃縮至1 mL。

土壤樣品(番茄栽培根際土壤和無番茄栽培土壤)預(yù)處理：取1 g土壤于10 mL離心管中，加入3 mL CH2Cl2，超聲萃取15 min，4 000 r·min-1離心5 min，傾出上清液于10 mL K-D濃縮管中，重復(fù)3次，合并有機(jī)相，在N2吹脫下濃縮至1 mL。

PAEs含量測定：采用Agilent 6890N/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀(石英毛細(xì)管柱HP-5MS)，升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?00 ℃，保持1 min，20 ℃·min-1升至280 ℃，保持3 min。載氣He，流量1.0 mL·min-1，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣1 μL，進(jìn)樣口和檢測器溫度250 ℃，EI源70 eV[18]。

1.6 微生物測定

細(xì)菌和真菌的測定采用稀釋平板法，具體步驟參考范秀榮的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[19]。細(xì)菌培養(yǎng)2 d，真菌培養(yǎng)5 d后計(jì)數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)和加入的菌液量計(jì)算出菌落個(gè)數(shù)，單位：CFU·g-1土(干重)。

可降解菌的測定步驟參考Toyama的方法[20]，無機(jī)鹽培養(yǎng)基中包含15 mg·L-1的DBP和DEHP，以DBP和DEHP作為唯一碳源，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后計(jì)數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)和加入的菌液量計(jì)算出菌落個(gè)數(shù)，單位為CFU·g-1土(干重)。無機(jī)鹽培養(yǎng)基的配方為每升水中含有Na2HPO40.20 g，KH2PO41.0 g，NaCl 1.0 g，NH4NO30.5 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，CaCl20.1 g，F(xiàn)eCl30.01 g，瓊脂15 g；pH=7.2。

1.7 生物富集系數(shù)

生物富集系數(shù)(bioconcentration factor, BCF)是描述化合物在生物體內(nèi)累積情況的重要指標(biāo)。BCF值是生物組織中化合物的濃度和試驗(yàn)結(jié)束后該化合物在土壤中的濃度之比。在本實(shí)驗(yàn)中即番茄果實(shí)中DBP、DEHP的檢出量與相應(yīng)盆栽后土壤中殘留DBP、DEHP的檢出量之比。

1.8 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，在α=0.05水平進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性差異檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 番茄植株不同部位中PAEs含量

(1)未滅菌番茄苗

不同PAEs染毒濃度下試驗(yàn)結(jié)束后，測定了未滅菌番茄植株各部位中DBP和DEHP的含量。由表2和表3可以看出，未滅菌番茄植株各部位DBP和DEHP的含量與土壤中DBP和DEHP濃度存在很好的相關(guān)性，隨著土壤中DBP和DEHP污染濃度由低到高，番茄植株各部位對DBP和DEHP的積累能力增強(qiáng)。

未滅菌番茄植株各部位DBP含量順序?yàn)楣麑?shí)>根>葉>莖，無論污染水平高低，各部位中DBP的含量表現(xiàn)出相同的順序。DEHP含量順序?yàn)楦?果實(shí)≥葉≥莖。

表1 污染土壤中鄰苯二甲酸正丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸異辛酯(DEHP)的初始濃度Table 1 Initial concentration of dibutyl phthalate (DBP) and di-2-ethylhexyl phthalate (DEHP) in polluted soil

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

Note: The data in the
Table were average value ± standard deviation.

同一污染水平下根系DEHP含量均高于DBP，而在果實(shí)和莖葉中DBP的含量均高于DEHP?？赡苁且?yàn)镈BP的分子量和KOW較小，不易被土壤吸附，更容易被番茄根系吸收并向地上部位(莖、葉和果實(shí))運(yùn)移，而DEHP的分子量和KOW較大，更容易被土壤吸附滯留在番茄根部[21]。這與大棚中實(shí)地調(diào)查蔬菜中PAEs的污染結(jié)果相一致。

(2)滅菌番茄苗

表4和表5為不同PAEs染毒濃度下，試驗(yàn)結(jié)束后無菌番茄植株各部位DBP和DEHP含量。不同染毒濃度下生長的番茄植株，其果實(shí)、根、莖和葉中均檢出DBP和DEHP，番茄植株各部位中DBP和DEHP含量與土壤中DBP和DEHP污染濃度密切相關(guān)，番茄植株各部位DBP和DEHP含量順序與未滅菌番茄基本一致。

表2 未滅菌番茄植株各部位DBP含量(鮮重)Table 2 Content of DBP in different parts of non-sterilized tomato plants (fresh weight)

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同大寫字母表明同一處理不同部位含量差異達(dá)0.05顯著水平，不同小寫字母表示同一部位不同處理間含量差異達(dá)0.05顯著水平，下同。

Note: The data in the
Table were average value ± standard deviation. Values in each row followed with different capital letters (A, B, C, D) indicated significant differences between different parts samples. Values in each line followed with different lowercase letters (a, b, c) indicated significant differences between different spiking PAE concentrations. The same below.

表3 未滅菌番茄植株各部位DEHP含量(鮮重)Table 3 Content of DEHP in different parts of non-sterilized tomato plants (fresh weight)

表4 無菌番茄植株各部位DBP含量(鮮重)Table 4 Content of DBP in different parts of sterilized tomato plants (fresh weight)

表5 無菌番茄植株各部位DEHP殘留量(鮮重)Table 5 Content of DEHP in different parts of sterilized tomato plants (fresh weight)

2.2 不同處理方式土壤中DBP和DEHP的殘留特征

表6為不同處理方式土壤中DBP和DEHP的殘留量。無論種植番茄前土壤中PAEs污染水平高低，4個(gè)不同處理方式土壤中DBP和DEHP的殘留量順序均為：滅菌土壤組>滅菌土壤種植番茄苗組>未滅菌土壤組>未滅菌土壤種番茄苗組。顯而易見，同一污染水平下滅菌處理后土壤中的DBP和DEHP殘留量大大超過對應(yīng)的未滅菌處理組，可能是因?yàn)闇缇笸寥乐形⑸锸セ钚裕@說明微生物活性對土壤中污染物的降解起著至關(guān)重要的作用[21]。

不同處理方式中，未滅菌土壤種植番茄組DBP和DEHP的削減能力最強(qiáng)，高達(dá)96.39%，更進(jìn)一步說明了DBP和DEHP的削減是番茄苗栽培過程中植物和微生物共同作用的結(jié)果。這除了番茄植株的吸收富集作用外，可能隨著番茄植株的生長，植物根系分泌物為根際微生物的生存提供了碳源和能源，使得利用DBP和DEHP的微生物數(shù)量增加，從而大大提高了DBP和DEHP的削減能力[22-23]。

2.3 收獲期后不同處理組土壤中微生物種類和數(shù)量

低、中、高3個(gè)不同污染水平的土壤種植番茄，在收獲期后土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌和PAEs可降解菌數(shù)量(CFU·g-1土)如圖1所示。由圖1可以看出：

(1)有番茄苗組土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌和PAEs可降解菌的數(shù)量均大于等于無番茄苗組，比值分別介于4.5～11.0、1.0～10.0和2.1～2.6之間。這說明番茄在生長過程中番茄植株根系分泌的碳源和能源促進(jìn)了根際微生物的生長和繁殖，顯著提高了根際微生物數(shù)量和活性，研究表明，根際土壤中微生物數(shù)量一般比非根際土壤高5～20倍，最高可達(dá)100倍[22-23]。進(jìn)一步說明了DBP和DEHP的削減是番茄苗栽培過程中植物根系分泌物促進(jìn)了根際微生物及降解菌的生長，進(jìn)而促進(jìn)了PAEs的降解，因此可以說明PAEs的削減是番茄苗栽培過程中植物和微生物協(xié)同作用的結(jié)果。

(2)可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌數(shù)量隨著PAEs初始濃度的增加而降低，而PAEs可降解菌數(shù)量隨PAEs初始濃度的增加而增加，增加幅度不大。這可能是因?yàn)镻AEs對可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌有一定的毒害作用，使得一部分可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌在PAEs污染的環(huán)境中無法生存，導(dǎo)致其數(shù)量隨PAEs初始濃度的增加而降低；而可降解菌是在PAEs污染環(huán)境中能夠存活下來的那部分微生物，隨著時(shí)間的延長和PAEs初始濃度的增加，可降解菌對PAEs產(chǎn)生一定的耐受作用。

2.4 番茄果實(shí)對DBP和DEHP的富集

表7為番茄果實(shí)對PAEs的生物富集系數(shù)，無論滅菌與否，隨著土壤中DBP和DEHP污染水平的增加，番茄果實(shí)對DBP和DEHP的富集系數(shù)降低，即污染嚴(yán)重的地方番茄果實(shí)對DBP和DEHP的富集系數(shù)較低，這與前人研究水生植物對有機(jī)污染物的富集時(shí)的結(jié)果一致[24-25]。

表6 收獲期后不同處理組土壤中DBP和DEHP殘留量Table 6 Residual amount of DBP and DEHP in soils of different treatments after harvest

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同大寫字母表明不同處理方式同一染毒濃度土壤殘留量差異達(dá)0.05顯著水平，不同小寫字母表示同一處理方式不同染毒濃度土壤殘留量差異達(dá)0.05顯著水平。

Note: The data in the
Table were average value and standard deviation. Values in each row followed with different capital letters (A, B, C, D) indicated significant differences between different treatment methods. Values in each line followed with different lowercase letters (a, b, c) indicated significant differences between different spiking PAE concentrations.

圖1 收獲期后土壤中微生物含量注：PAEs表示鄰苯二甲酸酯；低、中、高表示PAEs的3個(gè)不同污染水平，其濃度分別為10.0、20.0和50.0 mg·kg-1。Fig. 1 The content of microorganisms in soils after harvest Note: PAEs stands for phthalate esters. Low, medium and high indicated three different levels of PAE pollution, and the concentration were 10.0, 20.0 and 50.0 mg·kg-1, respectively.

未滅菌番茄果實(shí)對DBP和DEHP的富集系數(shù)大于無菌番茄果實(shí)，其比值分別為11.3～21.7和3.7～8.4。這可能是由于未滅菌土壤中DBP和DEHP容易被微生物降解，土壤中DBP和DEHP含量較低的緣故。

番茄果實(shí)對DBP的富集系數(shù)大于DEHP，這與前人報(bào)道的蔬菜、花生對PAEs的富集結(jié)果相一致[26,12]。這可能與污染物的理化性質(zhì)(水溶解度、揮發(fā)性和Kow等)有關(guān)，DBP的Kow值和相對分子量較DEHP低，在土壤中更容易揮發(fā)和降解導(dǎo)致土壤中其殘留量較小，而DEHP親脂性強(qiáng)、支鏈較長，難以在土壤中降解導(dǎo)致土壤中其殘留量較大[25]；還可能是DBP和DEHP在植物體內(nèi)的遷移能力不同所造成的，植物可以通過其根系從土壤間隙水中吸收有機(jī)化合物，而這種能力的強(qiáng)弱與被吸收的有機(jī)物的Kow值有關(guān)[27-28]。

綜上所述：(1)番茄植物根系、莖、葉和果實(shí)均可以吸收PAEs類化合物，各部位中DBP和DEHP含量與土壤中DBP和DEHP的污染水平成正相關(guān)。相同處理的番茄莖、葉和果實(shí)中DBP含量均高于DEHP，而番茄根系中DEHP的含量高于DBP。(2)未滅菌組土壤中PAEs含量均低于滅菌組，有番茄苗組土壤中PAEs類化合物含量均低于無番茄苗組。(3)有番茄苗組土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌和PAEs可降解菌的數(shù)量均大于等于無番茄苗組。(4)未滅菌土壤種植番茄苗組DBP和DEHP的削減能力最強(qiáng)，高達(dá)96.39%。番茄植物生長過程中增強(qiáng)了微生物對污染物的削減能力，番茄植物本身的吸收富集也削減了污染物，但造成了番茄的污染，食用果實(shí)可能存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。

表7 番茄果實(shí)對PAEs的富集系數(shù)Table 7 Bioaccumulation factors of phthalate acid esters (PAEs) in tomato fruit