郎朗，董曉琪，狄靜波

1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)中藥學(xué)博士后科研流動(dòng)站，哈爾濱 150076 2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076

有機(jī)氯類農(nóng)藥曾被廣泛用于農(nóng)林領(lǐng)域，但因其難降解，易通過食物鏈生物富集和放大，危害人類健康，已被列為持久性有機(jī)污染物，雖已于1983年停止生產(chǎn)和使用，但在環(huán)境和多種植物中仍可檢出[1]。筆者課題組在前期實(shí)驗(yàn)中，檢測了東北地區(qū)中藥材中有機(jī)氯類農(nóng)藥的殘留量，雖然單一有機(jī)氯類農(nóng)藥含量未超出國家標(biāo)準(zhǔn)，但其聯(lián)合毒性效應(yīng)需引起關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)選取雌激素受體陽性的乳腺癌MCF-7細(xì)胞為受試對(duì)象，研究了六氯苯、β-六六六和p,p’-滴滴涕單一和聯(lián)合毒性作用。采用MTT法考察3種農(nóng)藥單獨(dú)和聯(lián)合作用時(shí)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長的影響，用流式細(xì)胞儀檢測有機(jī)氯類農(nóng)藥聯(lián)合作用時(shí)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期分布的影響，用Western Blot法檢測有機(jī)氯類農(nóng)藥聯(lián)合作用時(shí)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中ERα、ERβ、ERK1/2、p-ERK1/2、Ki67、c-Myc和CyclinD1蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

乳腺癌MCF-7細(xì)胞由哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心提供；雌二醇(E2，純度≥98%)購自美國Sigma公司；六氯苯(HCB，純度≥99%)購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；β-六六六(β-BHC，純度≥99%)、p,p’-滴滴涕(p,p’-DDT，純度≥99%)購自天津市農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；溴化四氮唑藍(lán)(MTT，純度≥97.5%)購自美國Sigma公司；兔抗ERα、ERβ、ERK1/2和p-ERK1/2多克隆抗體購自北京市中杉生物技術(shù)有限公司；兔抗Ki67、CyclinD1多克隆抗體和人β-肌動(dòng)蛋白抗體購自北京市博奧森生物技術(shù)有限公司。WELLSCAN MK 3型酶標(biāo)儀、EPS-300型電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 殘留劑量下有機(jī)氯類農(nóng)藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響

乳腺癌MCF-7細(xì)胞饑餓培養(yǎng)3 d(無酚紅RPMI1640培養(yǎng)液，含10%去雌激素的胎牛血清)，稀釋為4×104個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液，按每孔4 000個(gè)接種于96孔板中，24 h后，加入不同濃度藥物，陽性對(duì)照組加入E2，濃度為1.0×10-8mol·L-1。單一給藥設(shè)3組，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)中檢測到的中藥材中有機(jī)氯類農(nóng)藥的殘留量，確定毒性實(shí)驗(yàn)劑量[2]，HCB濃度為3.5×10-9mol·L-1，β-BHC濃度為7.4×10-9mol·L-1，p,p’-DDT濃度為5.4×10-8mol·L-1。設(shè)4個(gè)聯(lián)合用藥組，分別為HCB+β-BHC、HCB+p,p’-DDT、β-BHC+p,p’-DDT、HCB+β-BHC+p,p’-DDT(均為等效劑量)。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組(0.1%濃度的正己烷)，每個(gè)劑量組設(shè)6個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后，測定OD490值。計(jì)算細(xì)胞增殖率(proliferation rate, PR)：

1.2.2 殘留劑量下有機(jī)氯類農(nóng)藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期的影響

饑餓培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，稀釋后加入6孔板，按每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，每孔加1 mL的藥液。給藥組為E2組、β-BHC+p,p’-DDT聯(lián)合組、HCB+β-BHC+p,p’-DDT聯(lián)合組和溶劑對(duì)照組(均為等效劑量)。每組設(shè)3個(gè)平行樣，48 h后收集細(xì)胞，離心后用PBS沖洗。用預(yù)冷的70%乙醇在4 ℃冰箱里固定細(xì)胞12 h后，離心后倒去固定液，加入配好的PI染液500 μL，室溫孵育30 min，過300目濾網(wǎng)，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 Western Blot法測定增殖相關(guān)蛋白

饑餓培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，稀釋為1.0×106個(gè)·mL-1，分裝于培養(yǎng)瓶中，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量后，加入蛋白上樣緩沖液煮沸備用，制備100 g·L-1SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳。采用濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀將凝膠蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜用含5% BSA的TBST溶液于室溫條件下封閉2 h。利用TBST緩沖液漂洗PVDF膜3次，每次15 min，然后與相應(yīng)的一抗在4 ℃條件下孵育過夜。TBST洗膜3次，每次15 min，然后加入二抗(堿磷酶標(biāo)記羊抗鼠或羊抗兔IgG)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次15 min，化學(xué)發(fā)光法檢測，圖像采集，ImageJ軟件進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果(Results)

2.1 殘留劑量下有機(jī)氯類農(nóng)藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，3種有機(jī)氯類農(nóng)藥單獨(dú)或聯(lián)合誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞24、48和72 h后，分別計(jì)算各組平均OD值，經(jīng)分析可知，殘留劑量下3種農(nóng)藥分別作用于細(xì)胞24、48和72 h后，細(xì)胞增殖與對(duì)照組比較無明顯差異(P>0.05)。當(dāng)農(nóng)藥聯(lián)合作用時(shí)，在24、48 h時(shí)β-BHC+p,p’-DDT組、HCB+β-BHC+p,p’-DDT組細(xì)胞增殖有顯著提高(P<0.01)，與E2組作用相似。β-BHC+p,p’-DDT組和HCB+β-BHC+p,p’-DDT組24 h增殖率分別為115.0%和120.1%，48 h增殖率分別為121.2%和126.3%。作用72 h時(shí)，各組與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。

圖1 殘留劑量下有機(jī)氯類農(nóng)藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響(n=6)注：與對(duì)照組相比，*P<0.05、** P<0.01。E2表示雌二醇，濃度為1.0×10-8 mol·L-1；HCB、β-BHC和p,p'-DDT分別表示六氯苯、 β-六六六和p,p'-滴滴涕，其殘留濃度分別為3.5×10-9 mol·L-1、7.4×10-9 mol·L-1和5.4×10-8 mol·L-1。Fig. 1 Effect of organochlorine pesticides on the proliferation of breast cancer MCF-7 cells at the residual dose (n=6) Note: compared with control, * P<0.05, ** P<0.01. E2 stands for estradiol, and its concentraiton is 1.0×10-8 mol·L-1; HCB, β-BHC and p,p'-DDT stand for hexachlorobenzene, β-hexahexachlorocyclohexane and p,p'-clofenotane; their residual doses were 3.5×10-9 mol·L-1, 7.4×10-9 mol·L-1 and 5.4×10-8 mol·L-1.

2.2 殘留劑量下有機(jī)氯類農(nóng)藥聯(lián)合對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞的增殖和分化受細(xì)胞的Gl、S、G2和M 4個(gè)時(shí)期嚴(yán)格調(diào)控，殘留劑量下有機(jī)氯類農(nóng)藥聯(lián)合對(duì)細(xì)胞周期的作用如表1所示，β-BHC+p,p’-DDT組與HCB+β-BHC+p,p’-DDT組、E2組與對(duì)照組相比G1期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)，S期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.01)，G2/M期細(xì)胞比例無明顯變化(P>0.05)。2種農(nóng)藥聯(lián)合組使乳腺癌MCF-7細(xì)胞的S期細(xì)胞比例顯著增加，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

表1 殘留劑量下有機(jī)氯類農(nóng)藥作用乳腺癌 MCF-7細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期的變化Table 1 Changes of cell cycle of breast cancer MCF-7 cells treated with organochlorine pesticides at residual dose for 48 h n=3)

注：A為HCB，B為β-BHC，C為p,p’-DDT；與對(duì)照組相比，*P<0.05、**P<0.01。

Note: A represents HCB; B represents β-BHC; C represents p,p’-DDT; compared with control, *P<0.05, **P<0.01.

2.3 殘留劑量下有機(jī)氯類農(nóng)藥聯(lián)合對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的影響

2.3.1 殘留劑量下有機(jī)氯類農(nóng)藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞雌激素受體蛋白的誘導(dǎo)

Western Blot法檢測結(jié)果如圖2所示，β-BHC+p,p’-DDT組和HCB+β-BHC+p,p’-DDT組均能降低乳腺癌MCF-7細(xì)胞中ERα蛋白表達(dá)量，且HCB+β-BHC+p,p’-DDT組<β-BHC+p,p’-DDT組β-BHC+p,p’-DDT組>E2組。2個(gè)聯(lián)合組都可以通過ER通路誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖。

2.3.2 殘留劑量下有機(jī)氯類農(nóng)藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

如圖3所示，E2組、β-BHC+p,p’-DDT組和HCB+β-BHC+p,p’-DDT組與對(duì)照組相比，ERK1/2蛋白表達(dá)并無明顯變化(P>0.05)。

圖2 殘留劑量下有機(jī)氯類農(nóng)藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中ER蛋白的影響(n=3)注：與對(duì)照組相比，*P<0.05、**P<0.01。Fig. 2 Effects of organochlorine pesticides on ER protein in breast cancer MCF-7 cells at the residual dose (n=3) Note: compared with control, *P<0.05, **P<0.01.

圖3 殘留劑量下有機(jī)氯類農(nóng)藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中ERK蛋白的影響(n=3)Fig. 3 Effects of organochlorine pesticides on ERK protein in breast cancer MCF-7 cells at the residual dose (n=3)

如圖4所示，E2組、β-BHC+p,p’-DDT組和HCB+β-BHC+p,p’-DDT組與對(duì)照組相比，P-ERK1/2蛋白表達(dá)量均有升高(P<0.01)，且2個(gè)有機(jī)氯類農(nóng)藥聯(lián)合組的促增殖效應(yīng)強(qiáng)于E2組。

2.3.3 殘留劑量下有機(jī)氯類農(nóng)藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)

Ki67是一種只能在細(xì)胞核中進(jìn)行表達(dá)的增殖相關(guān)蛋白，是檢測細(xì)胞增殖活性的較好的指標(biāo)[3]。如圖5所示，與對(duì)照組相比，E2組和2個(gè)有機(jī)氯類農(nóng)藥聯(lián)合組均可使Ki67蛋白表達(dá)量升高(P<0.01)，

HCB+β-BHC+p,p’-DDT組作用強(qiáng)度高于β-BHC+p,p’-DDT組，而β-BHC+p,p’-DDT組與E2組作用強(qiáng)度相當(dāng)。

CyclinD1為ER調(diào)控的蛋白，當(dāng)雌激素作用時(shí)能升高細(xì)胞G1期的早、中期CyclinD1蛋白表達(dá)量，誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖。如圖6所示，與對(duì)照組相比，E2組和2個(gè)有機(jī)氯類農(nóng)藥聯(lián)合組均使CyclinD1蛋白表達(dá)量升高(P<0.01)，且作用強(qiáng)度序列為HCB+β-BHC+p,p’-DDT組>β-BHC+p,p’-DDT組>E2組。

圖4 殘留劑量下有機(jī)氯類農(nóng)藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中p-ERK蛋白的影響(n=3)注：與對(duì)照組相比，** P<0.01。Fig. 4 Effects of organochlorine pesticides on p-ERK protein in breast cancer MCF-7 cells at the residual dose (n=3) Note: compared with control, ** P<0.01.

圖5 殘留劑量下有機(jī)氯類農(nóng)藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中Ki67蛋白的影響(n=3)注：與對(duì)照組相比，** P<0.01。Fig. 5 Effects of organochlorine pesticides on Ki67 protein in breast cancer MCF-7 cells at the residual dose (n=3) Note: compared with control, ** P<0.01.

圖6 殘留劑量下有機(jī)氯類農(nóng)藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中CyclinD1蛋白的影響(n=3)注：與對(duì)照組相比，** P<0.01。Fig. 6 Effect of organochlorine pesticides on CyclinD1 protein in breast cancer MCF-7 cells at the residual dose (n=3) Note: compared with control, ** P<0.01.

蛋白轉(zhuǎn)錄因子c-Myc是乳腺癌細(xì)胞的特異性蛋白。如圖7所示，與對(duì)照組相比，E2組和2個(gè)有機(jī)氯類農(nóng)藥聯(lián)合組均可使c-Myc蛋白表達(dá)量升高(P<0.01)，且作用強(qiáng)度序列為HCB+β-BHC+p,p’-DDT組>BHC+p,p’-DDT組>E2組。

圖7 殘留劑量下有機(jī)氯類農(nóng)藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中c-Myc蛋白的影響(n=3)注：與對(duì)照組相比，** P<0.01。Fig. 7 Effect of organochlorine pesticides on c-Myc protein in breast cancer MCF-7 cells at the residual dose (n=3) Note: compared with control, ** P<0.01.

3 討論(Discussion)

筆者課題組前期研究中，檢測出東北地區(qū)中藥材中殘留的有機(jī)氯類農(nóng)藥主要包括HCB、β-BHC和p,p’-DDT等3種，當(dāng)單一存在時(shí)，殘留劑量均低于《中國藥典》的最低殘留量的參考值，未能誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖。但當(dāng)3種農(nóng)藥在此殘留劑量下兩兩聯(lián)合、三者聯(lián)合作用時(shí)，β-BHC+p,p’-DDT、HCB+β-BHC+p,p’-DDT組能促進(jìn)細(xì)胞增殖，其他組與對(duì)照組比較則無明顯變化，且HCB+β-BHC+p,p’-DDT組的增殖效果高于β-BHC+p,p’-DDT組?？赏茰yβ-BHC+p,p’-DDT組對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的影響存在著交互作用，使增殖效果顯著，而當(dāng)三者聯(lián)合作用時(shí)，HCB可能促進(jìn)了這種交互作用，此時(shí)增殖效果要強(qiáng)于β-BHC+p,p’-DDT組。

有機(jī)氯類農(nóng)藥作為一類典型的具有雌激素活性的污染物，不僅能與雌激素核受體(nuclear estrogen receptor, nER)直接結(jié)合，激活下游靶基因的表達(dá)，還可通過活化雌激素膜受體(membrane estrogen receptor, mER)激活ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮雌激素作用，進(jìn)而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[4]。當(dāng)3種農(nóng)藥在殘留劑量下，β-BHC+p,p’-DDT組與HCB+β-BHC+p,p’-DDT組作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，雌激素信號(hào)首先通過活化mER使其與信號(hào)分子c-Src或轉(zhuǎn)接蛋白(adaptor)等結(jié)合，激活ERK/MAPK通路,促進(jìn)細(xì)胞中的p-ERK1/2的表達(dá)，p-ERK將雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)至核內(nèi)，與nER結(jié)合后使Hsp90游離，導(dǎo)致ER結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而調(diào)控下游基因的變化。除此之外，雌激素信號(hào)分子還會(huì)與nER直接結(jié)合，以二聚體形式與靶基因ERE結(jié)合，調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和相關(guān)基因或蛋白的表達(dá)。ERα和ERβ分別為ER受體的2種亞型，ERα可通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)細(xì)胞周期因子或其他生長因子影響細(xì)胞增殖。ERβ可結(jié)合雌激素激活mRNA轉(zhuǎn)錄，對(duì)調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡有重要意義[5-7]。在兩者同時(shí)表達(dá)的狀態(tài)下，ERβ能夠抑制ERα的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，降低ERα對(duì)雌二醇的敏感性[8]，所以β-BHC+p,p’-DDT組與HCB+β-BHC+p,p’-DDT組作用于細(xì)胞后，使ERα表達(dá)量降低，ERβ表達(dá)量升高。c-Myc和Ki67是位于細(xì)胞核內(nèi)的增殖相關(guān)蛋白，c-Myc作為一種原癌基因有著調(diào)控細(xì)胞周期的重要作用。Ki67常在增殖細(xì)胞中表達(dá)，受細(xì)胞周期調(diào)控[9]。c-Myc和Ki67作為細(xì)胞周期因子，可通過ERα、ERβ激活并表達(dá)。CyclinD1作為一種周期蛋白，能促進(jìn)細(xì)胞增殖。c-Myc、Ki67的表達(dá)與CyclinD1表達(dá)存在正相關(guān)性，也就是說c-Myc、Ki67表達(dá)量的升高能夠促進(jìn)CyclinD1的表達(dá)量的升高，而CyclinD1的過度表達(dá)將會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞增殖。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，殘留的有機(jī)氯類農(nóng)藥能夠激活ERK/MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)p-ERK的表達(dá)，轉(zhuǎn)導(dǎo)雌激素信號(hào)入核，活化ERα、ERβ蛋白，進(jìn)而激活下游的轉(zhuǎn)錄因子c-Myc、Ki67和CyclinD1蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究為有機(jī)氯類農(nóng)藥雌激素活性作用機(jī)制研究提供了理論依據(jù)。

綜上所述：(1)殘留劑量下，HCB、β-BHC和p,p’-DDT這3種農(nóng)藥單一作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞時(shí)，由于劑量較低未能促進(jìn)細(xì)胞增殖，β-BHC+p,p’-DDT組與HCB+β-BHC+p,p’-DDT組因存在著交互作用使增殖作用更顯著，且HCB+β-BHC+p,p’-DDT組增殖作用強(qiáng)于β-BHC+p,p’-DDT組。

(2)殘留劑量下，β-BHC+p,p’-DDT組和HCB+β-BHC+p,p’-DDT組作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞，使S期細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組，細(xì)胞呈明顯的增殖狀態(tài)。

(3)殘留劑量下，β-BHC+p,p’-DDT組和HCB+β-BHC+p,p’-DDT組激活經(jīng)典的ERK-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，受體酪氨酸激酶和適配體蛋白→Ras→Raf→MEK→ERK1/ERK2→轉(zhuǎn)錄因子→細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化等相關(guān)基因表達(dá)，使細(xì)胞S期細(xì)胞數(shù)上升，最終誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。