王毅，彭銘，高欣，趙寶玉，吳晨晨

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100

瘋草是黃芪屬(Astragaius)與棘豆屬(Oxytropis)有毒植物的統(tǒng)稱(chēng)，是目前世界上危害最大，影響草原畜牧業(yè)發(fā)展最嚴(yán)重的一類(lèi)有毒植物，家畜大量采食后引發(fā)機(jī)體生產(chǎn)性能下降，甚至死亡[1-2]。瘋草中毒的母畜不僅易發(fā)生流產(chǎn)、胎兒浸溶等，還可能誕下弱胎、死胎、畸形胎或腐胎等，同時(shí)胎盤(pán)上皮細(xì)胞、卵巢黃體和流產(chǎn)胎兒的實(shí)質(zhì)器官出現(xiàn)不同程度的空泡變性[3-7]。公畜則出現(xiàn)繁殖能力降低，嚴(yán)重者甚至死亡[8]。

苦馬豆素(swainsonine, SW)是瘋草主要有毒成分，是一種吲哚茲啶生物堿，因?yàn)槠潢?yáng)離子空間結(jié)構(gòu)與甘露糖苷水解過(guò)程中形成的甘露糖陽(yáng)離子半椅狀結(jié)構(gòu)相類(lèi)似，并對(duì)α-甘露糖苷酶有非常高的親和力，所以會(huì)抑制α-甘露糖苷酶正常生理功能[9-10]。α-甘露糖苷酶是N-聚糖加工過(guò)程中主要的修飾酶，苦馬豆素中毒同時(shí)可以競(jìng)爭(zhēng)性地抑制溶酶體內(nèi)α-甘露糖苷酶，引起大量的混合天冬酰胺低聚糖堆積在溶酶體內(nèi)，蛋白質(zhì)合成受阻，從而導(dǎo)致細(xì)胞廣泛性的空泡變性和壞死[11-14]。糖蛋白是分支的寡糖鏈與多肽鏈共價(jià)相連所構(gòu)成的復(fù)合糖，主鏈較短，在大多數(shù)情況下，糖的含量小于蛋白質(zhì)[15]。糖蛋白激素是一種通過(guò)2個(gè)不同的糖基化亞基之間非共價(jià)作用形成的異二聚體[16]。并且，糖蛋白激素具有特異性的膜受體，受體的結(jié)合情況取決于是否形成了完整的α/β異二聚體，糖蛋白激素的亞基具有較高的序列及結(jié)構(gòu)相似性，其中哺乳動(dòng)物中α-亞基的氨基酸序列都相當(dāng)保守，但是β-亞基卻具有激素特異性和種間的特異性。這種特異性決定了激素的生物活性和免疫活性[17]。由垂體前葉釋放的促性腺激素屬于糖蛋白激素：包括黃體生成素(luteinizing hormone, LH)、促卵泡生成激素(follicle-stimulating hormone, FSH)和絨毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin, CG)。下丘腦分泌促性腺釋放激素作用于垂體，繼而引起垂體分泌促性腺激素(FSH和LH)，然后作用于性腺，性腺分泌類(lèi)固醇激素如雌激素(estradiol, E2)和孕激素(progesterone, P4)，作用于卵巢，影響卵泡發(fā)育[17-18]。合成類(lèi)固醇激素的組織器官主要是在腎上腺皮質(zhì)、睪丸、卵巢和胎盤(pán)，這些器官中含有不同種類(lèi)、數(shù)量的固醇激素合成酶，它們可以產(chǎn)生各種不同的激素。常見(jiàn)的調(diào)控類(lèi)固醇激素生成的分子包括：類(lèi)固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory, StAR)、3-β羥基類(lèi)固醇脫氫酶(3-β hydroxysteroid dehydrogenase, 3-βHSD)和細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(cytochrome P450 cholesterol side chain lyase, P450scc)[19]。

筆者課題組前期研究表明：苦馬豆素中毒后α-甘露糖苷酶活性降低，糖蛋白激素肽鏈上N-聚糖糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起糖蛋白激素活性發(fā)生改變[20]。那么苦馬豆素中毒后N-聚糖加工過(guò)程中其他的糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶活性是否也發(fā)生變化？苦馬豆素中毒后生殖激素水平及其受體和類(lèi)固醇激素限速酶如何改變？因此在本試驗(yàn)中，筆者應(yīng)用苦馬豆素對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，分別于妊娠后7 d、15 d和分娩后7 d采集血液、子宮和卵巢組織。應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)4種生殖激素受體在卵巢上的核酸表達(dá)量，應(yīng)用ELISA的方法檢測(cè)糖基轉(zhuǎn)移酶活性和生殖激素水平，應(yīng)用Western-blot檢測(cè)性類(lèi)固醇激素限速酶蛋白表達(dá)量。以此來(lái)分析苦馬豆素中毒致N-聚糖加工過(guò)程的異常對(duì)生殖激素及其受體表達(dá)量的影響，為以后瘋草中毒致家畜生殖性能紊亂的分子生物學(xué)機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物的分組與染毒

隨機(jī)選取6～8周齡雌性昆白小鼠60只，分為2組，一組為試驗(yàn)組，腹腔注射苦馬豆素(n=30，1/10 LD50為0.04 mg·kg-1)，一組為對(duì)照組，腹腔注射生理鹽水(n=30，0.04 mg·kg-1)[20]。每隔1 d染毒一次，連續(xù)染毒21 d后，按雌雄比例為2:1進(jìn)行合籠，雌性小鼠繼續(xù)攻毒，隔2 d注射一次。分別在妊娠期7 d、15 d和分娩后7 d處死(每次每組5只)，收集小鼠血液、子宮和雙側(cè)卵巢組織，記錄母鼠產(chǎn)仔數(shù)。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，分析純?nèi)燃淄橘?gòu)自洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司，分析純無(wú)水乙醇購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×PCR Taq MasterMix/with dye購(gòu)自ABCOM，組織蛋白抽提試劑盒、熒光染料SYBR Green I購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，引物來(lái)自北京奧科鼎盛生物科技有限公司，小鼠溶酶體α-甘露糖苷酶-I試劑盒、小鼠高爾基體α-甘露糖苷酶-Ⅱ試劑盒、小鼠N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ試劑盒和小鼠N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶-Ⅱ試劑盒購(gòu)自江西海聯(lián)生物科技有限公司，5X蛋白上樣緩沖液購(gòu)自西安赫特生物科技有限公司(HEART)，Aromatase兔抗鼠抗體、StAR兔抗鼠抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology，3-βHSD兔抗鼠抗體、β-Actin兔抗鼠抗體購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司(Abcam)，山羊抗兔抗體購(gòu)自安諾倫(北京)生物科技有限公司(ZETA)，牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，PVDF膜購(gòu)自廣州賽國(guó)生物科技有限公司(Biosharp)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取小鼠卵巢總RNA

卵巢放置液氮中磨碎并加入裂解液RZ。將樣品置于裂解液RZ中5 min(15～30 ℃)。4 ℃下以12 000 r·min-1離心5 min后，吸出上清液然后加入到另一個(gè)不含RNA酶的離心管中。在離心管中加入200 μL氯仿，震蕩15 s后，于室溫下靜置3 min。4 ℃下以12 000 r·min-1離心10 min，樣品會(huì)被劃分為3層，上層水相中含有RNA。將水相轉(zhuǎn)移至新管中，加入0.5倍體積的無(wú)水乙醇并充分混勻。將溶液倒入吸附柱CR3中，4 ℃下以12 000 r·min-1離心30 s，排出收集管中液體。吸取已加入乙醇的去蛋白液RD 500 μL于吸附柱CR3中，4 ℃下以12 000 r·min-1離心30 s，排出液體后將CR3放入收集管。吸取已加入乙醇的漂洗液RW 500 μL于吸附柱CR3中，4 ℃下以12 000 r·min-1離心30 s，排出液體。將吸附柱放置在2 mL收集管，4 ℃下以12 000 r·min-1離心2 min，排出液體。將吸附柱CR3放入1.5 mL的離心管，加100 μL不含RNA酶的ddH2O，4 ℃下以12 000 r·min-1離心2 min，所得液體為RNA。提取RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

表1 4種激素受體的引物序列Table 1 Primer sequences for four hormone receptors

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)Gene Bank設(shè)計(jì)促卵泡素、促黃體素、孕酮和雌二醇受體4個(gè)因子以及類(lèi)固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)、3-β羥基類(lèi)固醇脫氫酶(3-βHSD)、細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc)和細(xì)胞色素P450芳香酶(cytochrome P450 aromatase, P450arom，由CYP19基因編碼)的引物序列如表1所示，并按照表2體系進(jìn)行反應(yīng)。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系Table 2 Realtime-PCR reaction system

將上述混合液體放置在PCR儀上，開(kāi)始設(shè)置反應(yīng)程序：預(yù)變性設(shè)置為3 min、95 ℃，然后進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：變性設(shè)置為30 s、95 ℃，退火為30 s、50～60 ℃，延伸為32 s、72 ℃，設(shè)置40次循環(huán)。

1.3.3 卵巢組織總蛋白質(zhì)提取

應(yīng)用組織蛋白抽提試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行：取出Tissue Protein Extraction Reagent進(jìn)行預(yù)冷，解剖小鼠摘掉卵巢，置于提前高壓滅菌并預(yù)冷的研缽中，加入液氮進(jìn)行研磨，研磨時(shí)及時(shí)加入液氮防止融化降解。將研磨的粉末加入離心管中放置2～3 min后，取適量的Tissue Protein Reagent并按照體積比為1∶99加入Protease Inhibitor Cocktail，即1×工作液。每1 g組織中加入10 mL 1×工作液勻漿處理。而后置于冰上孵育20 min，在離心機(jī)中10 000 r·min-1離心20 min。將得到的上清液移到新管中，準(zhǔn)備蛋白含量測(cè)定。

1.3.4 蛋白質(zhì)濃度的檢測(cè)

使用TIANGEN BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。(1)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋?zhuān)河门c樣品相同緩沖體系的稀釋劑對(duì)BSA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋(具體參數(shù)如表3所示)。(2)配制BCA工作液：按照所提取的蛋白量制備適量BCA工作液，并輕搖至充分混勻。(3)微管測(cè)定方法：分別取25 μL新鮮配制的BSA標(biāo)準(zhǔn)液和待檢測(cè)的樣品蛋白，加入96孔板中。在每個(gè)孔中加入200 μL BCA工作液，然后輕輕混勻。加蓋，放入37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育30 min或者在室溫中放置2 h。之后放到酶標(biāo)儀中，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)562 nm處的吸光度。根據(jù)酶標(biāo)儀所測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品的蛋白濃度。

表3 牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋Table 3 Bovine serum albumin (BSA) standard sample dilution

1.3.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)法

清洗薄厚玻璃板，并用去離子水沖洗干凈，裝入制膠架中，用移液槍加入攪拌充分的10%分離膠，室溫靜置30 min后加入混勻充分的5%濃縮膠并插入梳子。室溫靜置30 min后，置入電泳槽中加入新配制的1×電泳液，拔出梳子，加入樣液和蛋白maker，80 V電泳30 min然后再100 V電泳1 h。電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，根據(jù)凝膠塊大小剪取濾紙和PVDF膜(面積：濾紙>膜>膠)，將其全部浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中15 min，其中膜需提前浸泡甲醇5 min，然后按濾紙-膠-膜-濾紙的“三明治”方式重疊，不能有氣泡；100 V轉(zhuǎn)膜50 min。轉(zhuǎn)膜后把膜放入5% BSA封閉液中室溫封閉2 h，然后放入配制好的一抗中4 ℃過(guò)夜，第2天拿出膜用TBST清洗，每次10 min，一共清洗6次。在用適當(dāng)濃度的二抗室溫孵育2 h，清洗6次每次10 min，表面涂新配制的發(fā)光液，放入儀器內(nèi)曝光，觀察蛋白條帶。

1.3.6 ELISA法分析糖基轉(zhuǎn)移酶和生殖激素的活性

(1)將試劑盒在室溫下放置20 min后，從鋁箔袋中取出所需板條。(2)吸取不同濃度50 μL標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品孔中。(3)空白孔不加入待測(cè)樣品，而將50 μL待測(cè)樣品加入樣本孔中。(4)吸取100 μL帶有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體加入每個(gè)孔中，空白孔除外，然后用封板膜封住反應(yīng)孔并于恒溫箱溫育60 min或水浴鍋水浴37 ℃。(5)棄去液體，殘余水分用吸水紙吸干，每孔加入350 μL洗滌液，放置1 min，棄去洗滌液，殘余水分用吸水紙吸干，用此法洗5次。(6)在每個(gè)孔中加入50 μL的A液和B液，37 ℃避光孵育15 min。(7)在每個(gè)孔中加入終止液50 μL，于15 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。

1.3.7 PAS染色法

糖原染色法即將新鮮組織編號(hào)取材后投入AFF液、Carnoy固定液或者放入冰箱內(nèi)低溫固定。放入無(wú)水酒精中脫水、二甲苯透明、浸蠟和包埋。常規(guī)切片厚5 μm，脫蠟至水；使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～1%的高碘酸試劑氧化5～10 min，環(huán)境溫度以下不高于20 ℃為宜，室溫高時(shí)氧化時(shí)間適當(dāng)縮短。流水沖洗5 min，再用去離子水沖洗2次；Schiff氏液從冰箱取出升至室溫后，避光染色10～30 min；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的偏重亞硫酸鈉每次浸洗1～2 min，一共2次，以達(dá)到分化的目的；流水沖洗5～10 min，去離子水沖洗；Haris蘇木精染2～5 min，去離子水沖洗；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸酒精分化，再用去離子水充分沖洗；溫水(或者質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氨水)返藍(lán)，核染色稍淺為好；流水沖洗，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示試驗(yàn)數(shù)據(jù)。使用SPSS13.0(SPSS, Chicago. IL. USA)分析數(shù)據(jù)，包含2個(gè)相關(guān)樣本分析。結(jié)果中，概率(P)值低于0.05可認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*P<0.05，試驗(yàn)組與對(duì)照組同一時(shí)間階段進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果(Results)

2.1 苦馬豆素對(duì)仔鼠存活率的影響

雌性小鼠妊娠7 d、15 d和分娩后7 d觀察小鼠產(chǎn)仔數(shù)和仔鼠存活率。如表4所示，染毒組仔鼠在妊娠7 d和15 d的存活率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2 小鼠子宮糖原染色

妊娠期后7 d、15 d和分娩后7 d采取小鼠子宮組織，應(yīng)用PAS法染色，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，染毒組小鼠分娩后7 d，小鼠子宮內(nèi)膜固有層上出現(xiàn)大量紅色糖類(lèi)物質(zhì)沉積，并在子宮內(nèi)膜上出現(xiàn)大量的空泡變性，如圖1所示。

2.3 苦馬豆素對(duì)小鼠血液中生殖激素含量的影響

收集2組雌性小鼠妊娠期7 d、15 d和分娩后7 d血液，檢測(cè)血液中雌二醇、孕酮、促卵泡素和促黃體素水平(圖2)。結(jié)果顯示，在妊娠后15 d和分娩后7 d，染毒組小鼠血液中雌二醇和孕酮的含量顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)；在妊娠期后7 d、15 d和分娩后7 d，染毒組小鼠血液中促卵泡素和促黃體素的含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表4 雌性小鼠產(chǎn)仔數(shù)Table 4 Number of litters of female mice

注：*P<0.05，相同時(shí)間內(nèi)，同組比較兩者之間差異顯著。

Note: *P<0.05, at the same time, the difference between the two groups is significant.

圖1 妊娠小鼠子宮糖原染色注：C. 對(duì)照組，T. 染毒組；1. 妊娠期后7 d，2. 妊娠期后15 d，3. 分娩后7 d。Fig. 1 Uterine glycogen staining in pregnant mice Note: C. control group, T. test group; 1. 7 days after pregnancy, 2. 15 days after pregnancy, 3. 7 days after childbirth.

圖2 苦馬豆素對(duì)小鼠血液生殖激素水平的影響注：與對(duì)照組相比，* P<0.05。E2為雌激素，P4為孕激素，F(xiàn)SH為卵泡刺激素，LH為促黃體生成素。Fig. 2 Effect of swainsonine on blood reproductive hormone levels in mice Note: compared with the control, * P<0.05. E2 stands for estrogen; P4 stands for progesterone; FSH stands for follicle stimulating hormone; LH stands for luteinizing hormone.

2.4 苦馬豆素對(duì)小鼠生殖激素受體mRNA表達(dá)量的影響

在小鼠妊娠7 d、15 d和分娩后7 d，收集2組雌性小鼠卵巢組織，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠卵巢中4種生殖激素受體mRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示：在妊娠7 d和15 d，染毒組小鼠孕激素受體(progesterone receptor, PR)、雌二醇受體(estradiol receptor, ER)、促卵泡素受體(follicle stimulating hormone receptor, FSHR)和促黃體素受體(luteinizing hormone receptor, LHR)mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。在分娩后7 d，染毒組小鼠PR、FSHR和LHR mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而ER mRNA表達(dá)量略低于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)(表5)。

2.5 苦馬豆素對(duì)小鼠糖基轉(zhuǎn)移酶活性的影響

應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)小鼠子宮溶酶體α-甘露糖苷酶-(圖3a)、高爾基體α-甘露糖苷酶-Ⅱ(圖3b)、N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ(圖3c)和N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶-Ⅱ(圖3d)的酶活性。結(jié)果顯示：在妊娠7 d，染毒組小鼠溶酶體α-甘露糖苷酶-Ⅰ、高爾基體α-甘露糖苷酶-Ⅱ和N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶-Ⅱ的活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而與對(duì)照組相比，染毒組小鼠子宮N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ的活性差異不顯著(P>0.05)；在妊娠15 d和分娩后7 d，染毒組小鼠溶酶體α-甘露糖苷酶-Ⅰ、高爾基體α-甘露糖苷酶-Ⅱ、N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ和N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶-Ⅱ的活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.6 小鼠性類(lèi)固醇激素限速酶蛋白表達(dá)量

收集各組小鼠卵巢組織，在妊娠7 d、15 d以及分娩后7 d，提取總蛋白質(zhì)及總RNA，通過(guò)Western Blot以及RT-PCR檢測(cè)P450scc、StAR、3-βHSD和CYP19A1的蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)量(圖4)。在妊娠7 d、15 d和分娩后7 d，染毒組與對(duì)照組小鼠比較，卵巢中P450scc和StAR蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。妊娠7 d，染毒組和對(duì)照組小鼠卵巢中3-βHSD和CYP19A1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在妊娠15 d和分娩后7 d，染毒組小鼠卵巢3-βHSD和CYP19A1蛋白表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。妊娠7 d、15 d和分娩后7 d，染毒組和對(duì)照組小鼠卵巢中P450scc和StAR mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。妊娠7 d，染毒組和對(duì)照組小鼠卵巢中3-βHSD和CYP19A1 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。妊娠15 d和分娩后7 d，染毒組小鼠卵巢中3-βHSD和CYP19A1 mRNA表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

瘋草的主要有毒成分是吲哚里西啶類(lèi)生物堿苦馬豆素，其含量直接影響瘋草的毒性[21]。Huang等[22]發(fā)現(xiàn)低劑量苦馬豆素不會(huì)引起黃體細(xì)胞損傷并促進(jìn)孕酮分泌，而高劑量苦馬豆素可誘導(dǎo)黃體細(xì)胞凋亡并抑制黃體中孕酮分泌。Wu等[20]發(fā)現(xiàn)苦馬豆素影響小鼠的發(fā)情周期和生殖性能。

苦馬豆素陽(yáng)離子與甘露糖苷水解過(guò)程中形成的甘露糖陽(yáng)離子在結(jié)構(gòu)上有相似性，均呈半椅狀空間結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致苦馬豆素對(duì)甘露糖苷酶表現(xiàn)出高度的親和性。并且甘露糖苷酶作用的靶間室中pH通常為4.5，這使苦馬豆素表現(xiàn)出弱堿性，從而使其成為α-甘露糖苷酶的強(qiáng)烈抑制劑[23]。α-甘露糖苷酶是N-聚糖加工過(guò)程中的關(guān)鍵酶，由于苦馬豆素對(duì)于α-甘露糖苷酶有強(qiáng)烈的抑制作用，故而引起N-聚糖加工過(guò)程紊亂。在N-聚糖加工過(guò)程中起主要催化作用的酶有α-甘露糖苷酶和N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶。N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶位于真核生物的高爾基體中，是一種催化N-聚糖核心D-甘露糖(Man)與UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-Glc NAc)中的GlcNAc連接，形成N-糖鏈分支結(jié)構(gòu)的酶類(lèi)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔注射苦馬豆素后，不僅溶酶體α-甘露糖苷酶-Ⅰ和高爾基體α-甘露糖苷酶-Ⅱ的活性受到抑制，N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ和N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶-Ⅱ的活性也受到抑制。這表明苦馬豆素對(duì)N-聚糖加工過(guò)程中的關(guān)鍵酶均有顯著抑制作用，進(jìn)而導(dǎo)致N-聚糖加工過(guò)程紊亂。

表5 各處理組生殖激素受體mRNA表達(dá)量Table 5 The mRNA expression of reproductive hormone receptor in different groups

注：PR、ER、FSHR和LHR分別表示孕激素受體、雌激素受體、卵泡刺激素受體和黃體生成素受體。*P<0.05，相同時(shí)間內(nèi)，與相應(yīng)的對(duì)照組比較差異顯著。C1、C2和C3分別代表對(duì)照組小鼠妊娠7 d、15 d和妊娠后7 d；T1、T2和T3分別代表染毒組小鼠妊娠7 d、15 d和妊娠后7 d。

Note: PR, ER, FSHR, LHR stand for progesterone receptor, estrogen receptor, follicle stimulating hormone receptor, luteinizing hormone receptor. *P<0.05, at the same time, the difference is significant compared with the corresponding control. C1, C2, C3 represent the control group on 7th day, 15th day after pregnancy and 7th day after childbirth; T1, T2, T3 represent the exposed group on 7th day, 15th day after pregnancy and 7th day after childbirth.

圖3 苦馬豆素對(duì)小鼠子宮糖基轉(zhuǎn)移酶活性的影響注：與對(duì)照組相比，* P<0.05。a. 溶酶體α-甘露糖苷酶-Ⅰ；b. 高爾基體 α-甘露糖苷酶-Ⅱ；c. N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ；d. N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶-Ⅱ。Fig. 3 Effect of swainsonine on uterine glycosyltransferase activity in mice Note: compared with the control, * P<0.05. a. lysosomal α-mannosidase-Ⅰ; b. Golgi α-mannosidase-Ⅱ; c. N-acetylglucosamine transferase-Ⅰ; d. N-acetylglucosamine transferase-Ⅱ.

圖4 小鼠性類(lèi)固醇激素限速酶蛋白與基因表達(dá)量注：與對(duì)照組相比，* P<0.05。Fig. 4 The steroid hormone rate-limiting enzyme protein and gene expression in mice Note: compared with the control, * P<0.05.

圖5 苦馬豆素對(duì)生殖激素作用機(jī)理Fig. 5 Mechanism of action of swainsonine on reproductive hormones

糖蛋白(glycoprotein)是分支的寡糖鏈與多肽鏈共價(jià)相連所構(gòu)成的復(fù)合糖，主鏈較短，在大多數(shù)情況下，糖的含量小于蛋白質(zhì)。同時(shí)，糖蛋白還是一種結(jié)合蛋白質(zhì)，糖蛋白是由短的寡糖鏈與蛋白質(zhì)共價(jià)相連構(gòu)成的分子，糖鏈作為綴合蛋白質(zhì)的輔基[23]。促性腺激素(gonadotropin, Gn)是一類(lèi)糖蛋白激素，它通常包括：黃體生成素、促卵泡生成激素和絨毛膜促性腺激素，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物性腺發(fā)育來(lái)促進(jìn)性激素的生成和分泌。糖蛋白激素與其受體結(jié)合后，通過(guò)cAMP途徑，促進(jìn)E2和P4合成與分泌，作用于卵巢，影響卵泡發(fā)育[24]。促性腺激素是由α、β兩條肽鏈通過(guò)非共價(jià)鍵的方式組合而成，其中α-肽鏈結(jié)構(gòu)性同，β-肽鏈具有較大差異性，可以識(shí)別并結(jié)合靶組織的特異受體[25]。本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果表明，苦馬豆素中毒可導(dǎo)致促性腺激素肽鏈上的糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[20]。糖蛋白是蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)糖基化修飾后才可發(fā)揮其生物學(xué)功能，那么N-聚糖糖鏈結(jié)構(gòu)的改變勢(shì)必會(huì)影響糖蛋白激素的分泌紊亂。本研究同樣發(fā)現(xiàn)苦馬豆素中毒可導(dǎo)致妊娠期小鼠生殖激素分泌紊亂。下丘腦促黃體生成激素釋放激素、促性腺激素和性激素的分泌之間互相聯(lián)系，通過(guò)下丘腦激素分泌軸可以得知性激素是促性腺激素的靶腺產(chǎn)物，而下丘腦促黃體生成激素釋放激素調(diào)控垂體促性腺激素的合成和分泌，所以這3種激素分泌量之間的變化互相影響，具有一定的周期性(圖5)[20]。另外，在雌激素和孕激素與它們的受體結(jié)合形成復(fù)合物后，受體三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，激素受體復(fù)合物被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，并以高親和力與目標(biāo)DNA結(jié)合，以二聚體的形式誘發(fā)或抑制轉(zhuǎn)錄。由于苦馬豆素使N-聚糖加工過(guò)程紊亂，苦馬豆素影響促卵泡素和促黃體素的分泌，使功能性促卵泡素和促黃體素含量下降，通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸，隨血流到達(dá)卵巢的促卵泡素和促黃體素含量下降，與其受體結(jié)合后，對(duì)卵巢等組織分泌的雌激素和孕激素也起到了抑制作用[25]。生殖激素與其受體結(jié)合后才能發(fā)揮生理活性，因此，苦馬豆素中毒后引起妊娠期生殖激素及其受體表達(dá)量降低，致使染毒組小鼠產(chǎn)仔數(shù)和活胎數(shù)顯著低于對(duì)照組。

圖6 生殖類(lèi)固醇激素合成關(guān)鍵步驟簡(jiǎn)圖Fig. 6 Schematic diagram of key steps in reproductive steroid synthesis

下丘腦分泌促性腺釋放激素作用于垂體，垂體正反饋?zhàn)饔梅置诖傩韵偌に兀缓笞饔糜谛韵?，促使性腺分泌雌激素和孕激?屬于類(lèi)固醇激素)，目前研究證明苦馬豆素可以抑制促性腺激素的分泌，促性腺激素在卵巢類(lèi)固醇激素的形成中起重要作用[26]。FSH刺激芳香酶的表達(dá)，雌激素在顆粒細(xì)胞中合成，F(xiàn)SH可增加顆粒細(xì)胞中細(xì)胞色素P450芳香酶(P450arom，由CYP19基因編碼)的表達(dá)和活性，LH可增加黃體細(xì)胞中P450scc的表達(dá)，二者分別增加了雌二醇和孕酮的含量[27]。另外，LH可以與卵泡膜細(xì)胞上的LH受體結(jié)合并促進(jìn)膜細(xì)胞中雄激素的合成，產(chǎn)生的雄激素穿過(guò)基底膜進(jìn)入粒狀細(xì)胞[28]。FSH與顆粒細(xì)胞上的FSH受體結(jié)合并激活芳香酶的表達(dá)。在這種酶的作用下，雄激素被芳香化成雌激素。LH還可以通過(guò)cAMP/PKA信號(hào)通路調(diào)節(jié)性類(lèi)固醇生成途徑中重要調(diào)節(jié)酶StAR、P450scc、3-βHSD和CYP19的轉(zhuǎn)錄。類(lèi)固醇生成酶在類(lèi)固醇激素的生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用[29]。StAR的表達(dá)催化線(xiàn)粒體內(nèi)膜膽固醇和細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈切割酶P450scc的組合以產(chǎn)生類(lèi)固醇。這是類(lèi)固醇激素生產(chǎn)的第一個(gè)酶促步驟(圖6)[30]。在P450scc的作用下，膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮。作為前體，孕烯醇酮通過(guò)3-βHSD的作用代謝成黃體酮[31]。在細(xì)胞色素P45017α-羥化酶的催化作用下，孕酮被用作產(chǎn)生雄激素的底物[32]。最后，雄烯二酮或睪酮用作合成雌二醇的底物，由細(xì)胞色素P450芳香酶催化。本試驗(yàn)結(jié)果表明：苦馬豆素中毒小鼠卵巢的P450scc和StAR蛋白的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異，而3-βHSD和CYP19A1則明顯下調(diào)?？囫R豆素中毒僅影響甾體激素妊娠后期階段類(lèi)固醇限速酶的表達(dá)。類(lèi)固醇激素活性的下降主要是由于FSH和LH含量降低，正向?qū)е骂?lèi)固醇物質(zhì)的合成減少，從而負(fù)反饋調(diào)節(jié)導(dǎo)致類(lèi)固醇激素限速酶減少，引起雌二醇和孕酮含量下降。

綜上所述，苦馬豆素能顯著抑制N-聚糖加工過(guò)程的關(guān)鍵酶活性，進(jìn)而抑制N-聚糖的代謝過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)低聚糖大量蓄積，破壞了生殖器官的細(xì)胞功能。低聚糖的蓄積引起促性腺激素分泌降低，并且抑制類(lèi)固醇激素合成過(guò)程中后期限速酶的蛋白表達(dá)量，間接導(dǎo)致類(lèi)固醇激素(E2和P4)的水平下降，性類(lèi)固醇激素分泌紊亂；同時(shí)，苦馬豆素使妊娠期的生殖激素受體表達(dá)量下降，導(dǎo)致生殖激素與受體結(jié)合后活性下降，最終引起生殖機(jī)能障礙。