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        SCNN1B與胃癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)性實驗研究*

        2019-09-16 06:46:12柯東平毛俊倩郭甲民馬龍安
        陜西醫(yī)學雜志 2019年9期
        關(guān)鍵詞:孵育上皮標志物

        柯東平,毛俊倩,郭甲民,馬龍安

        陜西省腫瘤醫(yī)院(西安 710061)

        胃癌是一種起源于胃壁黏膜上皮細胞的惡性腫瘤,是發(fā)病率和病死率最高的消化道惡性腫瘤之一,全世界每年約有700,000例患者死于胃癌,其治療失敗的主要原因是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。研究顯示,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transitions,EMT)在腫瘤的發(fā)展過程中具有重要作用[2]。該過程上皮細胞失去細胞極性和細胞間粘附,同時獲得遷移和侵襲性,成為間充質(zhì)表型細胞,造成腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此,探究影響胃癌細胞EMT的靶向分子對胃癌的治療具有重要意義。SCNN1B位于16p12.2號染色體上,編碼上皮鈉通道(ENaC)的β亞單位,與α、γ亞單位組成多蛋白復合物,控制不同器官中水和電解質(zhì)的跨上皮轉(zhuǎn)運。同時,有報道顯示,包括SCNN1B編碼的β亞單位在內(nèi),ENaC亞單位均參與細胞分化[3],并且在多種癌細胞中編碼ENaC亞單位的基因啟動子區(qū)發(fā)生高甲基化導致基因沉默[4-5]。近來研究發(fā)現(xiàn),SCNN1B沉默與胃癌患者不良的疾病特異性和生存率顯著相關(guān)[6]。本研究擬采用SCNN1B過表達人胃癌細胞系SGC-7901細胞,建立胃癌裸鼠移植瘤模型,探究SCNN1B對胃癌移植瘤生長情況的影響及其與胃癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)性,為胃癌臨床治療提供新靶點。

        材料和方法

        1 主要材料 E-cadherin抗體、N-cadherin抗體(中國Proteintech);Vinmentin抗體、β-actin抗體、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國Wanleibio);HRP標記山羊抗兔IgG、HRP標記山羊抗小鼠IgG(美國ThermoFisher);蘇木精、山羊血清、DAB顯色液、SYBR Green(中國Solarbio);TRIpure、Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(中國BioTeke)。

        2 實驗方法

        2.1 細胞培養(yǎng):人胃癌細胞系SGC-7901細胞采用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。構(gòu)建針對人SCNN1B過表達載體,待SGC-7901細胞生長至90 %融合時,進行轉(zhuǎn)染,G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。

        2.2 裸鼠成瘤實驗:取4周齡雌性18~22 g,BALB/c裸鼠,隨機均分為未轉(zhuǎn)染組(Control)、空載體對照轉(zhuǎn)染組(Empty vector)、SCNN1B過表達轉(zhuǎn)染組(SCNN1B)。調(diào)整各組細胞密度,制備細胞懸液,于裸鼠右前肢皮下接種1×106個SGC-7901細胞,建立裸鼠移植瘤模型。常規(guī)飼養(yǎng)3周后處死裸鼠,剝?nèi)∧[瘤組織,觀察移植生長情況,部分用液氮凍存轉(zhuǎn)移至-70℃超低溫冰箱保存,部分用4 %多聚甲醛固定,用于后續(xù)實驗。

        2.3 Real-time PCR檢測移植瘤組織中SCNN1B和EMT標志分子mRNA的表達:采用TRIpure總RNA抽提試劑提取各組移植瘤組織樣本總RNA,并通過反轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA樣本。根據(jù)人相應基因序列,使用Primer premier 5.0軟件設(shè)計相應引物。取上述cDNA產(chǎn)物作為模板,采用Real-time PCR檢測SCNN1B、E-cadherin、N-cadherin及Vimentin mRNA的表達。

        表1 Real-time PCR引物序列

        2.4 Western blot檢測移植瘤組織中SCNN1B和EMT標志分子蛋白的表達:采用RIPA裂解液裂解各組移植瘤組織樣本,提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度,取40 μg蛋白樣本,進行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5 %脫脂奶粉溶液封閉,分別加入SCNN1B、E-cadherin、N-cadherin及Vimentin一抗4 ℃孵育過夜,HRP標記二抗37 ℃孵育45 min。ECL顯影,暗室曝光。采凝膠成像分析儀采集圖片,并用Gel-Pro-Analyzer軟件分析條帶的光密度值。

        2.5 免疫組化檢測腫瘤組織中EMT標志分子蛋白表達:制備石蠟組織切片,常規(guī)脫蠟至水,蒸餾水和PBS清洗后,置于抗原修復液內(nèi),低火持續(xù)加熱10 min;室溫下自然冷卻,滴加3 %過氧化氫溶液,孵育15 min;滴加山羊血清封閉15 min,完成后去除血清,勿洗,分別加入E-cadherin、N-cadherin及Vimentin一抗4 ℃孵育過夜,二抗37 ℃孵育30 min;DAB顯色、蘇木精復染、脫水透明處理;中性樹膠封片,晾干后于400×顯微鏡下觀察并攝圖記錄。

        3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計學軟件,計量資料以均數(shù)±標準差表示,t檢驗分析組間差異,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

        結(jié) 果

        1 SCNN1B過表達抑制胃癌移植瘤生長 采用BALB/c裸鼠皮下注射SCNN1B過表達SGC-7901細胞,培養(yǎng)3周。結(jié)果顯示,Control組和Empty vector組瘤體大小比較無統(tǒng)計學差異;與Empty vector組相比,SCNN1B組移植瘤的生長明顯受到抑制(圖1)。

        2 SCNN1B過表達效果驗證 采用Real-time PCR和Western blot檢測各組小鼠移植瘤組織中SCNN1B的表達情況,結(jié)果顯示,與Control組相比,Empty vector組移植瘤組織中SCNN1B mRNA和蛋白表達水平比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05);與Empty vector組相比,SCNN1B組移植瘤組織中SCNN1B mRNA和蛋白表達水平明顯升高,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,圖2)。

        圖1 各組小鼠移植瘤瘤體情況

        3 小鼠移植瘤組織中EMT標志物的表達情況 Real-time PCR和Western blot檢測各組小鼠移植瘤組織中EMT標志分子的表達情況,結(jié)果顯示,與Control組相比,Empty vector組移植瘤組織中上皮細胞標志物E-cadherin、間質(zhì)標志物N-cadherin及Vimentin mRNA和蛋白表達水平均無統(tǒng)計學差異(P>0.05);與Empty vector組相比,SCNN1B組移植瘤組織中E-cadherin mRNA和蛋白表達水平明顯升高,N-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白表達水平明顯降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,圖3)。

        圖2 移植瘤組織中SCNN1B表達情況(與Empty vector組相比,**P<0.01)

        圖3 移植瘤組織中EMT標志物表達情況(與Empty vector組相比,**P<0.01)

        4 SCNN1B過表達抑制胃癌細胞EMT 免疫組化結(jié)果顯示,陽性染色為棕黃色顆粒。與Control組相比,Empty vector組移植瘤組織中E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表達水平均無明顯變化;與Empty vector組相比,SCNN1B組移植瘤組織中E-cadherin蛋白表達水平明顯升高,N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平均明顯降低(圖4)。

        圖4 SCNN1B過表達對胃癌移植瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響(400×)

        討 論

        胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,也是第三大致人死亡的腫瘤疾病,給社會帶來巨大的壓力。由于胃癌早期臨床表現(xiàn)不典型,不易發(fā)現(xiàn),多數(shù)患者就診時已處于中晚期,加之治療手段有限,導致胃癌的治愈率并不高。當前,隨著分子靶向治療的深入開展,探究影響胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵分子對于有效治療胃癌的轉(zhuǎn)移具有重要意義。

        SCNN1B編碼上皮鈉通道(ENaC)的β亞單位,參與控制不同器官中水和電解質(zhì)的跨上皮轉(zhuǎn)運及細胞分化過程。目前關(guān)于ENaC在癌癥中的研究顯示,在乳腺癌、神經(jīng)母細胞瘤中,編碼ENaC α亞單位的SCNN1A基因啟動子區(qū)發(fā)生高甲基化引起的SCNN1A基因沉默,是上述腫瘤疾病患者預后較差的主要原因[4,7]。新近研究發(fā)現(xiàn),SCNN1B可以抑制胃癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移,且SCNN1B表達水平與胃癌患者生存率正相關(guān)[6],上述研究提示,SCNN1B在癌癥中發(fā)揮抑癌作用,然而,其作用機制卻鮮有相關(guān)文獻進行報道,因此,為進一步闡明SCNN1B在胃癌中的作用與機制,本研究使用過表達SCNN1B的人胃癌細胞系SGC-7901細胞建立裸鼠移植瘤模型,觀察SCNN1B過表達對胃癌移植瘤生長情況的影響。上述結(jié)果顯示,SCNN1B過表達后,移植瘤的生長明顯受到抑制表明SCNN1B能夠抑制體內(nèi)胃癌細胞的生長。

        上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的過程,與胚胎發(fā)育、傷口愈合及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)[8]。越來越多研究顯示,EMT在胃癌細胞生長、侵襲和遷移等過程中發(fā)揮重要作用[9-10]。為明確SCNN1B對胃癌細胞的影響是否與EMT相關(guān),本研究分別采用Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測過表達胃癌細胞形成的移植瘤組織中上皮細胞標志物E-cadherin、間質(zhì)細胞標志物N-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果顯示,在SCNN1B過表達胃癌細胞形成的移植瘤組織中,E-cadherin mRNA和蛋白表達水平均明顯上調(diào),N-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表達水平均明顯降低。同時,本研究進一步采用免疫組化檢測移植瘤組織中EMT標志分子蛋白的表達,結(jié)果同樣表明,SCNN1B過表達導致E-cadherin蛋白表達水平上調(diào),N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平下調(diào)。以上結(jié)果顯示,SCNN1B過表達抑制胃癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

        綜上所述,SCNN1B能夠通過抑制胃癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程對胃癌細胞移植瘤的生長起到明顯的抑制作用。因此,SCNN1B可能成為治療胃癌的潛在分子靶點。

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