李杰，普玲玲，王李雪，趙雨

(1.南陽理工學(xué)院 河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽 473004；2.南陽理工學(xué)院 生化學(xué)院，河南 南陽 473004)

花椒(Zanthoxylumbungeanum)是一種重要的香料和藥用經(jīng)濟(jì)作物，別名大椒、川椒或山椒，為蕓香科花椒屬灌木或小喬木植物花椒的干燥成熟果皮，主要產(chǎn)于遼寧、河南、陜西、山東、云南、四川等省份，目前已形成了山東泰安、四川茂漢、重慶江津、陜西韓城等一些全國聞名的種植基地[1-3]；值得一提的是，河南省南陽市淅川縣馬蹬鎮(zhèn)近年來致力于花椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，建成了多個萬畝花椒基地，馬蹬鎮(zhèn)花椒交易市場已成為中原最大的花椒交易市場，堪稱“中原花椒第一鎮(zhèn)”?；ń分谐袚]發(fā)油、酰胺、生物堿、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸等多種營養(yǎng)成分及生物活性成分外，還富含黃酮類化合物[4-6]。研究表明，黃酮類化合物具有多種生理活性，如抑菌、抗病毒、抗衰老、防癌抗癌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等[7,8]。黃酮類化合物分子中常含有一定數(shù)量的酚羥基，在機(jī)體中可迅速將氫質(zhì)子傳遞給自由基，終止自由基的氧化反應(yīng)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性[9]。

對花椒中的黃酮類化合物進(jìn)行提取，可開發(fā)成多種類型的功能食品及其他高附加值產(chǎn)品，有助于實(shí)現(xiàn)花椒資源的高值化利用，并帶動種植戶增收致富，促進(jìn)地方經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

黃酮類化合物的提取主要有溶劑浸提法、回流法、超聲波法、微波法等，其中，溶劑浸提法操作簡單、成本較低，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。但在具體提取操作時，影響其得率的因素較多，且因素與得率之間存在著復(fù)雜的非線性關(guān)系，采用常規(guī)方法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化時，需進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)，并需采用多元回歸的方法建立回歸方程擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對回歸方程進(jìn)行尋優(yōu)求解從而確定最優(yōu)提取工藝，使用時非常不便；當(dāng)前，人工智能領(lǐng)域的相關(guān)理論及實(shí)踐快速發(fā)展，為有效解決實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)過程中面臨的非線性系統(tǒng)的建模與優(yōu)化問題提供了新的途徑。

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是通過計(jì)算機(jī)模擬生物大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能而建立的信息處理系統(tǒng)，特別是基于誤差反向傳播算法的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對于具有復(fù)雜非線性關(guān)系的數(shù)據(jù)有較強(qiáng)的學(xué)習(xí)能力，在具有非線性關(guān)系的多因子試驗(yàn)的建模與系統(tǒng)優(yōu)化方面應(yīng)用廣泛[10]。但BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)主要是通過調(diào)節(jié)輸入層、隱含層及輸出層神經(jīng)元之間的權(quán)值和閾值對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，故不存在具體的數(shù)學(xué)表達(dá)式，無法通過傳統(tǒng)的優(yōu)化方法對其進(jìn)行求解[11,12]。而遺傳算法是借鑒進(jìn)化生物學(xué)中的自然選擇和遺傳進(jìn)化原理的優(yōu)化搜索算法，核心思想是將待求解問題的可行解進(jìn)行編碼表示成染色體，然后按照選擇、交叉和變異操作生成初始種群，并根據(jù)適應(yīng)度值大小篩選出一定數(shù)量優(yōu)秀染色體，反復(fù)進(jìn)行選擇、交叉、變異的迭代操作，直至獲得適應(yīng)度值最大的染色體，對染色體進(jìn)行解碼即可得最優(yōu)解[13,14]。

本文旨在Box-Behnken試驗(yàn)基礎(chǔ)上，在有限學(xué)習(xí)樣本約束條件下，通過BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)、訓(xùn)練，擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到網(wǎng)絡(luò)模型，再與遺傳算法結(jié)合優(yōu)化花椒黃酮提取工藝條件，并制備花椒黃酮提取液；同時考察花椒黃酮提取液對·OH、DPPH·及ABTS+·的清除能力，評價其體外抗氧化活性，以期為花椒資源綜合開發(fā)利用提供試驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

花椒：南陽淅川縣馬蹬鎮(zhèn)邢溝花椒基地。

1.1.2 試劑

蘆丁：中國藥品生物制品檢定所；DPPH、ABTS二銨鹽：上海北諾生物科技有限公司；石油醚(60～90 ℃)、無水乙醇、氯仿、正丁醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、鹽酸、雙氧水、硫酸亞鐵、抗壞血酸、過硫酸鉀、水楊酸等：均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

JJ-2植物粉碎機(jī) 北京維欣儀奧科技發(fā)展有限公司；Q/OANN 10-2008電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；CS101-1電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HZQ-X300C恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TDL-4A 臺式離心機(jī) 上海繼錦化學(xué)科技有限公司；UV757紫外分光光度計(jì) 鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取于105 ℃烘箱烘至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品15.0 mg，用50%乙醇進(jìn)行溶解并定容至100 mL，配成濃度為0.15 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液置于7個10 mL刻度試管中，再分別向刻度試管中加入2 mL 50%乙醇、0.5 mL 5% NaNO2，振蕩搖勻后靜置5 min，再分別加入0.5 mL 10% Al(NO3)3，振蕩搖勻后靜置5 min，最后分別加入3.0 mL 10% NaOH，震蕩均勻后用50%乙醇定容至刻度，靜置10 min，于507 nm波長處測定吸光度。以蘆丁含量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 y=0.3395x+0.0078(y為吸光度，x為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9975。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of rutin

1.2.2 花椒黃酮提取液的制備及得率計(jì)算

花椒粉碎后稱取適量用濾紙包好，細(xì)棉線扎緊，置于索氏提取器中，加入石油醚回流脫脂3 h，取出濾紙包，置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中低溫烘干石油醚，備用。用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇作提取劑，在不同試驗(yàn)條件下浸提，提取液于3000 r/min離心15 min，上清液加入Sevage試劑(正丁醇∶氯仿為1∶5，V/V)劇烈震蕩5 min脫蛋白，分液漏斗靜置20 min后分離除去蛋白層，重復(fù)脫蛋白5次得花椒黃酮提取液。

吸取適量花椒黃酮提取液，參考1.2.1的方法于507 nm 波長下測吸光度，與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對照，得出提取液中花椒黃酮的含量，計(jì)算花椒黃酮得率。

花椒黃酮得率(mg/g)=C×V/m。

式中：C為花椒黃酮提取液濃度(mg/mL)；V為花椒黃酮提取液體積(mL)；m為花椒原料質(zhì)量(g)。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別稱取經(jīng)粉碎及脫脂處理的花椒原料2.0 g，按照1.2.2的方法進(jìn)行震蕩提取(震蕩速率110 r/min)，并制備花椒黃酮提取液，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%、90%)、提取時間(30，60，90，120，150 min)、提取溫度(40，50，60，70，80 ℃)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，g/mL)等因素對花椒黃酮得率的影響。

1.2.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[15]，以花椒黃酮得率為響應(yīng)值，選取對花椒黃酮得率影響較大的乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、料液比(D)作為響應(yīng)因子，采用Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.2.5 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立

將Box-Behnken試驗(yàn)中的考察因素作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入層，輸入層設(shè)計(jì)4個神經(jīng)元，分別代表乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度及料液比；將響應(yīng)值作為輸出層，輸出層設(shè)計(jì)1個神經(jīng)元，代表花椒黃酮得率；設(shè)置不同的隱含層神經(jīng)元個數(shù)并進(jìn)行多次擬合比較，確定隱含層神經(jīng)元數(shù)量為8個；利用Matlab軟件編寫程序，建立BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[16]。

1.2.6 遺傳算法優(yōu)化求解

將訓(xùn)練后BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測結(jié)果(花椒黃酮得率)作為遺傳算法的個體適應(yīng)度函數(shù)值，根據(jù)適應(yīng)度值的大小，從每代個體中選出優(yōu)秀的個體，反復(fù)進(jìn)行選擇、交叉、變異的迭代運(yùn)算，直至獲得適應(yīng)度值最大(花椒黃酮得率最大)的個體，解碼即可得相應(yīng)參數(shù)(乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度、料液比)的實(shí)際值[17]。

1.2.7 花椒黃酮抗氧化活性評價

根據(jù)試驗(yàn)確定的最優(yōu)條件進(jìn)行花椒黃酮提取液的制備，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至0.6120 mg/mL后，采用倍比稀釋的方法得到一系列具有不同濃度梯度(0.6120，0.3060，0.1530，0.0765，0.0383，0.0191，0.0096，0.0048，0.0024，0.0012 mg/mL)的花椒黃酮提取液備用。

1.2.7.1 清除·OH活性測定

采用文獻(xiàn)[18,19]的方法稍微修改，向已清洗干凈的10支具塞刻度試管中分別加入6 mmol/L的FeSO4溶液2 mL，再分別向每支試管中加入事先制備的具有一系列濃度梯度的花椒黃酮提取液2 mL和6 mmol/L的H2O2溶液2 mL，采用漩渦振蕩器混勻，室溫靜置10 min后加入6 mmol/L的水楊酸醇溶液2 mL，采用漩渦振蕩器混勻后置于37 ℃水浴條件下反應(yīng)30 min，作為待測樣品；用相同體積的蒸餾水替代H2O2溶液作為對照組；用相同體積的蒸餾水替代花椒黃酮提取液作為空白組；用與花椒黃酮提取液濃度相同的Vc溶液作為陽性對照；以蒸餾水調(diào)零，在510 nm波長下分別測定樣品組、對照組、空白組及陽性對照組的吸光度，通過下式計(jì)算花椒黃酮提取液及與花椒黃酮提取液同濃度的Vc溶液對·OH的清除率，計(jì)算花椒黃酮提取液、Vc溶液的IC50值(自由基清除率為 50%時的濃度)。

1.2.7.2 清除DPPH·活性測定

采用文獻(xiàn)[20]的方法稍微修改，準(zhǔn)確配制0.5 mmol/L的DPPH乙醇溶液，向已清洗干凈的10支具塞刻度試管中分別加入2 mL已配制好的DPPH乙醇溶液、2 mL無水乙醇，再分別向試管中加入事先制備的具有一系列濃度梯度的花椒黃酮提取液2 mL，采用漩渦振蕩器混勻，在避光的條件下于25 ℃靜置30 min，作為待測樣品；用相同體積的無水乙醇替代DPPH溶液作為對照組；用相同體積的蒸餾水替代花椒黃酮提取液作為空白組；用與花椒黃酮提取液濃度相同的Vc溶液作為陽性對照；以無水乙醇調(diào)零，在517 nm波長下分別測定樣品組、對照組、空白組及陽性對照組的吸光度，通過下式計(jì)算花椒黃酮提取液及與花椒黃酮提取液同濃度的Vc溶液對DPPH·的清除率，計(jì)算花椒黃酮提取液、Vc溶液的IC50值。

1.2.7.3 清除ABTS+·活性測定

采用文獻(xiàn)[21,22]的方法稍微修改，ABTS+·儲備液的配制：將7.4 mmol/L的ABTS二銨鹽溶液和2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液以同樣的體積混合均勻，在25 ℃下置于暗處避光反應(yīng)16 h。ABTS+·工作液的配制：吸取1 mL ABTS+·儲備液用無水乙醇進(jìn)行稀釋，使其在734 nm波長下的吸光度為0.7±0.02，ABTS+·工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用。向已清洗干凈的10支具塞刻度試管中分別加入1.5 mL的ABTS+·工作液，再分別向試管中加入事先制備的具有一系列濃度梯度的花椒黃酮提取液0.5 mL，采用漩渦振蕩器混勻，在避光的條件下于25 ℃靜置10 min，作為待測樣品；用相同體積的蒸餾水替代ABTS+·工作液作為對照組；用相同體積的蒸餾水替代花椒黃酮提取液作為空白組；用與花椒黃酮提取液濃度相同的Vc溶液作為陽性對照；以蒸餾水調(diào)零，在734 nm波長下分別測定樣品組、對照組、空白組及陽性對照組的吸光度，通過下式計(jì)算花椒黃酮提取液及與花椒黃酮提取液同濃度的Vc溶液對ABTS+·的清除率，計(jì)算花椒黃酮提取液、Vc溶液的IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花椒黃酮得率的影響

分別稱取經(jīng)粉碎及脫脂處理的花椒原料2.0 g，按照1.2.2的方法進(jìn)行震蕩提取(震蕩速率110 r/min)，制備花椒黃酮提取液，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對花椒黃酮得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花椒黃酮得率的影響Fig.2 The effect of ethanol volume fraction on yield of Zanthoxylum bungeanum flavonoids

由圖2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～60%時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，花椒黃酮得率逐漸增加，可能是在提取劑作用下花椒細(xì)胞組織發(fā)生溶脹，易于黃酮類化合物的溶出；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，花椒黃酮得率逐漸降低，可能是由于提取劑極性下降，使得一部分脂溶性化合物溶出，導(dǎo)致花椒黃酮得率下降。

2.1.2 提取時間對花椒黃酮得率的影響

分別稱取經(jīng)粉碎及脫脂處理的花椒原料2.0 g，按照1.2.2的方法進(jìn)行震蕩提取(震蕩速率110 r/min)，制備花椒黃酮提取液，考察提取時間對花椒黃酮得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取時間對花椒黃酮得率的影響Fig.3 The effect of extraction time on yield ofZanthoxylum bungeanum flavonoids

由圖3可知，提取時間為30～90 min時，花椒黃酮得率隨著提取時間的增加逐漸增大；提取時間為90～150 min時，隨著提取時間的增加，花椒黃酮得率逐漸降低，可能是由于提取時間過長，部分花椒黃酮長時間受熱發(fā)生分解，導(dǎo)致得率下降。

2.1.3 提取溫度對花椒黃酮得率的影響

分別稱取經(jīng)粉碎及脫脂處理的花椒原料2.0 g，按照1.2.2的方法進(jìn)行震蕩提取(震蕩速率110 r/min)，制備花椒黃酮提取液，考察提取溫度對花椒黃酮得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對花椒黃酮得率的影響Fig.4 The effect of extraction temperature on yield ofZanthoxylum bungeanum flavonoids

由圖4可知，提取溫度在40～60 ℃范圍時，隨著提取溫度的增加，花椒黃酮得率逐漸增大；提取溫度超過60 ℃時，若提取溫度繼續(xù)增加，則花椒黃酮得率逐漸降低，可能是溫度過高，花椒黃酮過度受熱，苷元結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致得率降低。

2.1.4 料液比對花椒黃酮得率的影響

分別稱取經(jīng)粉碎及脫脂處理的花椒原料2.0 g，按照1.2.2的方法進(jìn)行震蕩提取(震蕩速率110 r/min)，制備花椒黃酮提取液，考察料液比對花椒黃酮得率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對花椒黃酮得率的影響Fig.5 The effect of solid-liquid ratio on yield ofZanthoxylum bungeanum flavonoids

由圖5可知，料液比小于1∶25(g/mL)時，隨著料液比的增加，花椒黃酮得率呈增加趨勢；料液比大于1∶25(g/mL)時，隨著提取劑用量的增加，黃酮得率逐漸下降。可能是由于料液比為1∶25(g/mL)時，花椒黃酮已基本溶出，若繼續(xù)增加提取劑用量，不利于花椒組織細(xì)胞層面的傳質(zhì)傳熱，其他醇溶性化合物也會與花椒黃酮相互競爭提取劑，使得黃酮得率降低。

2.2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立

根據(jù)1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，采用Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 The schedule and results of Box-Behnken experiment

續(xù) 表

隨機(jī)從Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果中選取24組數(shù)據(jù)作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)及訓(xùn)練樣本，剩余的3組數(shù)據(jù)作為檢驗(yàn)樣本，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)隱含層的傳遞函數(shù)采用“tansig”，輸出層的傳遞函數(shù)采用“purelin”，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)及訓(xùn)練采用“trainlm”算法，訓(xùn)練前使用“mapminmax”命令對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理；采用訓(xùn)練誤差平方和(mse)評估模型的性能，mse達(dá)到10-3停止訓(xùn)練。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)及訓(xùn)練過程見圖6，試驗(yàn)值與預(yù)測值對比見圖7。

圖6 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)及訓(xùn)練過程Fig.6 The learning and training process of BP neural network

圖7 試驗(yàn)值與BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測值的對比Fig.7 The comparison between experimental values and predictive values of BP neural network

由圖6可知，經(jīng)過7544次學(xué)習(xí)及訓(xùn)練，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的mse達(dá)到10-3，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)收斂，結(jié)束訓(xùn)練。由圖7可知，3個測試樣本在各自試驗(yàn)條件下的試驗(yàn)值分別為13.10，13.19，16.57 mg/g，經(jīng)學(xué)習(xí)及訓(xùn)練后的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在與測試樣本相同條件下的輸出值(即預(yù)測值)分別為13.1421，13.2294，16.5458 mg/g，輸出值和測試樣本之間的誤差較小，說明經(jīng)學(xué)習(xí)及訓(xùn)練后的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具有良好的預(yù)測性和準(zhǔn)確性，能夠反映乙醇濃度、提取時間、提取溫度、料液比與花椒黃酮得率之間的非線性關(guān)系，可利用遺傳算法對其進(jìn)行全局搜索優(yōu)化求得極值，從而確定花椒黃酮最優(yōu)的提取工藝條件。

2.3 遺傳算法優(yōu)化求解結(jié)果

根據(jù)1.2.6的方法對BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行優(yōu)化求解，遺傳算法尋優(yōu)初始種群規(guī)模27，初始種群個體輸入?yún)?shù)范圍分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)[50，70]、提取時間[60，120]、提取溫度[50，70]、料液比[20，30]；采用單點(diǎn)交叉，概率0.5，變異概率0.02，遺傳進(jìn)化200代。種群適應(yīng)度值(花椒黃酮得率)迭代變化曲線見圖8。

圖8 遺傳算法尋優(yōu)過程Fig.8 The optimizing computation process of genetic algorithm

由圖8可知，種群迭代進(jìn)化80代以后，種群適應(yīng)度值的變化逐漸平緩，迭代進(jìn)化100代后趨于穩(wěn)定。運(yùn)行程序進(jìn)行求解可得，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)最優(yōu)適應(yīng)度值(花椒黃酮得率)為19.6837 mg/g，對應(yīng)的各參數(shù)值為：乙醇體積分?jǐn)?shù)56.8310%，提取時間93.5554 min，提取溫度62.5623 ℃，料液比1∶27.7673(g/mL)。為便于實(shí)際操作，將各參數(shù)值進(jìn)行適當(dāng)修正，結(jié)果為：乙醇體積分?jǐn)?shù)57%，提取時間94 min，提取溫度63 ℃，料液比1∶28(g/mL)。

2.4 最優(yōu)提取工藝的驗(yàn)證

根據(jù)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法優(yōu)化求解修正后的花椒黃酮提取工藝參數(shù)，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并取平均值，結(jié)果花椒黃酮得率為19.7273 mg/g，變異系數(shù)CV(SD/Mean×100%)為2.15%，說明結(jié)果可信度較高，且與理論預(yù)測值相差不大，故確定花椒黃酮最優(yōu)提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)57%，提取時間94 min，提取溫度63 ℃，料液比1∶28(g/mL)。

2.5 花椒黃酮體外抗氧化活性評價結(jié)果

2.5.1 花椒黃酮提取液對·OH的清除作用

根據(jù)1.2.7.1的方法對花椒黃酮提取液清除·OH的活性進(jìn)行測定，結(jié)果見圖9。

由圖9可知，當(dāng)濃度小于0.0765 mg/mL時，花椒黃酮提取液和Vc溶液對·OH的清除力隨濃度的增加而迅速增大，兩者清除·OH的能力相差不大；當(dāng)濃度大于0.0765 mg/mL時，隨濃度的增大，花椒黃酮提取液和Vc溶液對·OH清除力增加趨勢變緩，但高濃度條件下，Vc溶液比花椒黃酮提取液清除·OH的能力更強(qiáng)?；ń伏S酮提取液清除·OH的IC50為0.0371 mg/mL，Vc溶液清除·OH的IC50為0.0239 mg/L，說明花椒黃酮提取液對·OH有較好的清除效果。

圖9 花椒黃酮提取液對·OH的清除效果Fig.9 The scavenging effect of Zanthoxylum bungeanum flavonoids extraction solution on ·OH

2.5.2 花椒黃酮提取液對DPPH·的清除作用

根據(jù)1.2.7.2的方法對花椒黃酮提取液清除DPPH·的活性進(jìn)行測定，結(jié)果見圖10。

圖10 花椒黃酮提取液對DPPH·的清除效果Fig.10 The scavenging effect of Zanthoxylum bungeanum flavonoids extraction solution on DPPH·

由圖10可知，花椒黃酮提取液和Vc溶液對DPPH·的清除率隨濃度的增加而增大，但花椒黃酮提取液對DPPH·的清除能力顯著弱于Vc溶液。花椒黃酮提取液清除DPPH·的IC50為0.0829 mg/mL，Vc溶液清除DPPH·的IC50為0.0305 mg/mL，花椒黃酮提取液和Vc溶液均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除DPPH·能力。

2.5.3 花椒黃酮提取液對ABTS+·的清除作用

根據(jù)1.2.7.3的方法對花椒黃酮提取液清除ABTS+·的活性進(jìn)行測定，結(jié)果見圖11。

由圖11可知，濃度在0～0.0191 mg/mL時，花椒黃酮提取液和Vc溶液對ABTS+·的清除率近乎呈直線上升；濃度在0.0191～0.1530 mg/mL時，兩者對ABTS+·的清除率增加緩慢；濃度在0.1530～0.6120 mg/mL時，兩者對ABTS+·的清除率增加趨于平緩?；ń伏S酮提取液清除ABTS+·的IC50為0.0175 mg/mL，Vc清除ABTS+·的IC50為0.0109 mg/mL，說明花椒黃酮提取液具有很好的清除ABTS+·自由基活性。

圖11 花椒黃酮提取液對ABTS+·的清除效果Fig.11 The scavenging effect of Zanthoxylum bungeanum flavonoids extraction solution on ABTS+·

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)的因素水平和響應(yīng)值，采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對影響花椒黃酮提取得率的4個主要因素與得率之間的非線性關(guān)系進(jìn)行了擬合建模，經(jīng)學(xué)習(xí)及訓(xùn)練后的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具有良好的預(yù)測性和準(zhǔn)確性，能夠反映乙醇濃度、提取時間、提取溫度、料液比和花椒黃酮得率之間的非線性關(guān)系，可利用遺傳算法對其進(jìn)行全局搜索優(yōu)化求得極值，從而確定花椒黃酮最優(yōu)的提取工藝條件。

將BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法相結(jié)合，精確求得了影響花椒黃酮提取得率的4個主要因素的最佳水平，并進(jìn)行驗(yàn)證，從而確定了花椒黃酮最優(yōu)提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)57%，提取時間94 min，提取溫度63 ℃，料液比1∶28(g/mL)。

體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果表明，花椒黃酮提取液具有較強(qiáng)的清除·OH、DPPH·及ABTS+·活性，其清除自由基的能力與花椒黃酮提取液濃度有明顯的量效關(guān)系。

綜上所述，本文基于花椒黃酮提取過程中提取工藝參數(shù)與得率之間存在的非線性關(guān)系，利用Box-Behnken試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，通過Matlab軟件編程，建立了能夠反映主要提取工藝參數(shù)與黃酮得率之間非線性關(guān)系的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，且經(jīng)學(xué)習(xí)及訓(xùn)練后的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具有良好的預(yù)測性和準(zhǔn)確性，并通過遺傳算法，實(shí)現(xiàn)了花椒黃酮提取工藝參數(shù)與得率的同步尋優(yōu)求解，為試驗(yàn)研究及生產(chǎn)實(shí)踐中面臨的具有非線性關(guān)系的多目標(biāo)同步優(yōu)化問題提供了一種新的解決方案；花椒黃酮提取液體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果表明，花椒黃酮具有顯著的自由基清除能力和抗氧化活性，其清除自由基的能力與花椒黃酮提取液濃度有明顯的量效關(guān)系。花椒黃酮作為一種天然的抗氧化劑，值得深入研究和開發(fā)，試驗(yàn)結(jié)果為南陽淅川縣馬蹬鎮(zhèn)花椒資源的綜合開發(fā)利用提供了有價值的參考。