袁樂梅，肖雄峻，邊名鴻，曾洪，陳強，張旭，楊中元

(1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000；2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000)

榨菜的原料青菜頭，學名“莖瘤芥”，分布于我國各地，收藏季節(jié)短，不易保存，因此大部分用于制作榨菜[1]。榨菜以獨特的加工工藝和脆嫩芳香的特點深受國內外消費者喜愛。但傳統(tǒng)自然發(fā)酵榨菜的鹽含量高并且存在大量亞硝酸鹽，不符合現(xiàn)代社會追求的綠色生活方式。少量的亞硝酸鹽可與蛋白質中的仲胺結合生成亞硝胺，有導致人體致癌的作用，而大量的亞硝酸鹽可導致腸原性青紫癥[2]。榨菜腌制中還存在有害微生物，使成品榨菜產生不良氣味，發(fā)生“漲袋”等現(xiàn)象[3]。而傳統(tǒng)榨菜的脫水方式分為風脫水和鹽脫水，其含鹽量均在12%以上，不符合世界衛(wèi)生組織建議的每日攝入食鹽量[4]。有研究表明，榨菜含鹽量的降低、酸度的提高以及乳酸菌對亞硝酸鹽的降解作用等都可以降低榨菜中的亞硝酸鹽含量[5]。另外，創(chuàng)造有利于乳酸菌、酵母菌等有益菌生長的微生態(tài)條件，控制腌制中的理化因素都可以用來調控發(fā)酵過程，以達到改善榨菜風味和質量的目的[6]。隨著這一發(fā)展趨勢，榨菜的研究越來越趨于低鹽化和接種發(fā)酵[7,8]。

本試驗將植物乳桿菌和漢遜酵母接種于低鹽榨菜發(fā)酵，植物乳桿菌產酸，漢遜酵母產香產酯，代替?zhèn)鹘y(tǒng)高鹽榨菜的發(fā)酵模式，探究新型低鹽榨菜發(fā)酵工藝；采用熱風烘脫水，可短時間降低榨菜的含水量，增加榨菜的脆度。加入氯化鈣，榨菜中的果膠酸與氯化鈣中的鈣離子結合生成不溶性的鈣鹽，從而彌補了乳酸菌接入導致榨菜脆度下降的缺陷，同時也保持了榨菜的形狀；白酒中含有酸類、酯類、醇類、芳香族化合物、縮醛類化合物等，為榨菜發(fā)酵增香提供了一定的前體物質，使產品產生獨特的滋味和芳香，另外白酒中的酒精也能產生較高的滲透壓和較強的殺菌能力，從而抑制了雜菌的生長，減少了防腐劑的使用。功能菌強化發(fā)酵技術應用于低鹽發(fā)酵蔬菜，對提升傳統(tǒng)產業(yè)水平和促進醬腌菜的現(xiàn)代化發(fā)展具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料

青菜頭：購于自貢市一對山菜市場，經(jīng)洗凈、修整、清洗、切條、熱風烘脫水、加鹽、氯化鈣、發(fā)酵菌接種發(fā)酵、包裝、后熟等處理；食鹽：自貢市燊海旅游開發(fā)有限責任公司生產的泡菜粒狀鹽；氯化鈣：浙江大成鈣業(yè)有限公司生產的食品級添加劑；白酒：北京紅星股份有限公司生產的56度紅星二鍋頭。

1.1.2 菌種

植物乳桿菌B1：從川西彝族傳統(tǒng)酸菜汁中分離所得；漢遜酵母Y2：四川輕化工大學釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸氫二銨2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，吐溫80 1 mL，加水定容為1000 mL，pH 6.2±0.2；用于發(fā)酵乳酸菌的擴大培養(yǎng)。

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母膏10 g，加水定容為1000 mL，pH 6.8±0.4；用于發(fā)酵酵母菌的擴大培養(yǎng)。

1.1.4 儀器

PHS-2C精密pH計 上海虹益儀器儀表有限公司；AX224ZH/E電子天平 奧豪斯儀器(常州)有限公司；WGZ精密鼓風干燥箱 上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司；HS-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 太倉市華利達實驗設備有限公司；TA-XT Plus質地分析儀 超技公司；756型紫外可見分光光度計 上海奧譜勒儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 榨菜腌制工藝

1.2.1.1 低鹽榨菜發(fā)酵工藝流程

1.2.1.2 傳統(tǒng)自然發(fā)酵榨菜工藝流程

鮮菜→修整→清洗→自然風干脫水→加鹽初腌→脫水→加鹽復腌→入壇發(fā)酵→成品菜胚。

1.2.2 低鹽榨菜工藝操作要點

1.2.2.1 預處理

摘除鮮菜中的雜物，清洗干凈后切成寬度為1～1.5 cm的菜條。

1.2.2.2 熱風烘脫水

將菜條置于溫度為60～65 ℃的環(huán)境中，在0.5～1.0 m/s的風速下脫水5～6 h，使菜條含水量降至75%以下，得脫水菜條。

1.2.2.3 加入食鹽、氯化鈣和白酒

將占脫水菜條質量4%～8%的食鹽、0.15%～0.45%的氯化鈣和1%～4%的白酒加入脫水菜條中，拌勻后腌制2～4 h。

1.2.2.4 噴灑接種

將占脫水菜條質量3‰～6‰的混合發(fā)酵液噴灑接種到腌制后的脫水菜條中，拌勻使菜條無成團現(xiàn)象；所述混合發(fā)酵液包括質量比為1∶1～2∶1的植物乳桿菌發(fā)酵液和漢遜酵母發(fā)酵液。

1.2.2.5 脫水

將經(jīng)過1.2.2.4處理的菜條裝入發(fā)酵容器中，密閉發(fā)酵25～30 d后取出榨菜，對榨菜進行脫水處理，將其含水量控制在60%～65%。

1.2.2.6 裝袋滅菌

將脫水后的榨菜裝袋、熱封，再進行巴氏殺菌，得榨菜成品。

1.2.3 菌株的擴大培養(yǎng)

以2%的接種量分別接種植物乳桿菌B1和漢遜酵母Y2至MRS和YPD液體培養(yǎng)基中，分別于37，30 ℃恒溫培養(yǎng)，用平板菌落計數(shù)法進行計數(shù)，當菌懸液中的細胞數(shù)達到108CFU/mL時到達擴培終點。將擴培后的菌懸液于4000 r/min的條件下離心15 min，洗滌，去除培養(yǎng)基對后續(xù)發(fā)酵的影響[9]。

1.2.4 傳統(tǒng)自然發(fā)酵、乳酸菌、混菌強化低鹽榨菜發(fā)酵對比分析

傳統(tǒng)自然發(fā)酵(A)：按照傳統(tǒng)自然發(fā)酵榨菜工藝進行發(fā)酵，初腌時加入6%的鹽，復腌時加入5%的鹽進行腌制；乳酸菌(B)、混菌(C)強化低鹽榨菜發(fā)酵：接種量為6‰，混菌發(fā)酵比例(植物乳桿菌∶漢遜酵母)為1∶1，65 ℃條件下低風速脫水6 h使榨菜的含水量降至75%，6%加鹽量，0.25%氯化鈣，3%白酒。3種榨菜均在25 ℃室溫下培養(yǎng)，每隔3 d取樣，測定OD值、酸度。當鹽度基本趨于一致、榨菜顏色均勻時發(fā)酵結束，測定3種榨菜的質構并進行感官品評。

1.2.5 低鹽榨菜發(fā)酵條件單因素試驗

1.2.5.1 接種量的確定

將清洗、修整好的鮮菜在65 ℃條件下低風速脫水6 h后，分別加入質量分數(shù)為2‰、4‰、6‰、8‰的乳酸菌菌懸液，按照1.2.4所示的乳酸菌強化低鹽榨菜發(fā)酵工藝，于室溫下培養(yǎng)40 d，每隔5 d取樣，測定其OD值、酸度，腌制結束后對其進行感官品評。

1.2.5.2 混菌發(fā)酵比例的確定

以6‰的接種量，植物乳桿菌∶漢遜酵母分別為0∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶0的比例噴灑接種到腌制后的脫水菜條中，按照1.2.4所示的混菌強化低鹽榨菜發(fā)酵工藝，于室溫下培養(yǎng)40 d，每隔5 d取樣，測定其OD值、酸度，腌制結束后對其進行感官品評。

1.2.5.3 白酒添加量的確定

鮮菜烘脫水至含水量75%以下后，分別按質量分數(shù)加入1%、3%、5%、7%的白酒，按照1.2.4所示的乳酸菌強化低鹽榨菜發(fā)酵工藝，于室溫下培養(yǎng)40 d，每隔5 d取樣，測定其OD值、酸度，腌制結束后對其進行感官品評。

1.2.5.4 氯化鈣添加量的確定

鮮菜在65 ℃條件下烘脫至含水量為75%以下后，添加3%的白酒后加入質量分數(shù)為0.1%、0.25%、0.4%、0.55%的氯化鈣，按照1.2.4所示的乳酸菌強化低鹽榨菜發(fā)酵工藝，于室溫下培養(yǎng)40 d，每隔5 d取樣，測定其OD值、酸度，腌制結束后對其進行感官品評。

1.2.6 新型低鹽榨菜發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

為了得到最適發(fā)酵條件，采用混菌強化低鹽榨菜發(fā)酵，在單因素試驗基礎上，設置三因素三水平的正交試驗，以觀察接種量(A)、混菌發(fā)酵比例(B)、白酒添加量(C)對榨菜品質的影響，各因素的水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.7 優(yōu)化條件與傳統(tǒng)自然發(fā)酵榨菜理化指標和感官評分對比

以最優(yōu)條件進行驗證試驗，每隔3 d測定其酸度和OD值，并將發(fā)酵完成后最優(yōu)條件的質構、發(fā)酵完成時間、含鹽量、氨基酸態(tài)氮、蛋白質、還原糖、亞硝酸鹽等含量與傳統(tǒng)自然發(fā)酵榨菜進行對比，以驗證感官品評的結果。其他條件遵循低鹽榨菜發(fā)酵工藝流程，選取新鮮原料進行發(fā)酵。

1.3 測定方法

1.3.1 感官品評方法

參考張赟彬等[10]的方法，其中色澤∶香氣∶滋味的分值比例為2∶3∶5。

1.3.2 榨菜理化指標測定方法

1.3.2.1 榨菜酸度的測定

使用PHS-2C精密pH計直接測定腌制榨菜鹵水[11]。

1.3.2.2 鹽度的測定

參照GB 5009.44-2016進行，采用其中的直接滴定法，在2次重復性的試驗中，測試結果的絕對差值應小于算術平均值的5%。

1.3.2.3 氨基酸態(tài)氮的測定

采用酸度計法，具體操作流程參照GB 5009.235-2016。其中榨菜樣品的處理方式為取20 g榨菜樣品研細，混合均勻，采用四分法，取5 g進行氨基酸態(tài)氮的測定。

1.3.2.4 質構分析方法

用質構測定儀分析榨菜條，使用P/2N探頭，測前后速率2 mm/s，測中速率1 mm/s，穿刺距離4 mm，從榨菜壇的四角和中部共取5組榨菜條為樣品進行分析[12]。

1.3.2.5 其他指標

蛋白質含量的測定：采用常量凱氏定氮法[13]；還原糖含量的測定：采用斐林試劑法；亞硝酸鹽含量的測定：參照GB 5009.33-2016中分光光度法下的鹽酸奈乙二胺法。

2 結果與分析

2.1 3種腌制榨菜鹵水細胞濃度(OD值)的變化

圖1 榨菜腌制過程中細胞濃度變化Fig.1 Changes of cell concentration during pickle salting process

從榨菜腌制開始，每隔3 d取榨菜的鹵水于600 nm波長處測定其吸光度值，以腌制0 h時的鹵水為參比。由圖1可知，腌制開始后，接種強化低鹽榨菜中的細胞濃度遠高于傳統(tǒng)自然發(fā)酵榨菜，其中混菌強化低鹽榨菜發(fā)酵的細胞濃度增長最快，并在短時間內細胞濃度趨于平穩(wěn)；植物乳桿菌單菌強化發(fā)酵的細胞濃度剛開始時高于傳統(tǒng)自然發(fā)酵，但當發(fā)酵進行至21 d時，其細胞濃度略低于傳統(tǒng)自然發(fā)酵，主要原因是長時間的榨菜腌制導致鹵水中的營養(yǎng)環(huán)境發(fā)生變化，植物乳桿菌進入穩(wěn)定期并慢慢走向衰亡。植物乳桿菌和漢遜酵母混菌強化低鹽榨菜發(fā)酵加速了榨菜的后熟，有利于縮短榨菜的發(fā)酵周期[14]。

2.2 3種腌制榨菜鹵水酸度的變化

圖2 榨菜發(fā)酵過程中酸度變化曲線Fig.2 The curves of acidity changes during pickle salting process

由圖2可知，菌株強化發(fā)酵使得發(fā)酵菌株快速成為優(yōu)勢菌株，初期pH快速下降，下降速度遠遠快于傳統(tǒng)自然發(fā)酵組，發(fā)酵20天左右時pH便降至4以下，從而達到抑制腐敗菌的作用，而傳統(tǒng)自然發(fā)酵組直至發(fā)酵完成，pH值也只在4.5左右徘徊；混菌強化發(fā)酵組的pH值則一直低于乳酸菌強化發(fā)酵組，pH值在發(fā)酵終點時達到3.6左右。在混菌強化發(fā)酵組中，由于植物乳桿菌和漢遜酵母的接入，使得植物乳桿菌在發(fā)酵開始就處于優(yōu)勢地位，加之漢遜酵母自身發(fā)酵產香產酯，多菌株酶系豐富，保證了發(fā)酵的正常進行，使底物分解更徹底，從而提升了產品的品質[15]。

2.3 3種榨菜菜胚質構分析

榨菜的成品測定數(shù)據(jù)見表2。

表2 榨菜成品測定數(shù)據(jù)Table 2 Determination data of pickle products

由表2可知，植物乳桿菌強化發(fā)酵組發(fā)酵周期為30 d，低于傳統(tǒng)自然發(fā)酵組(42 d)，平均內部脆度高于傳統(tǒng)自然發(fā)酵組，混菌強化發(fā)酵榨菜品質和感官評分均優(yōu)于單菌強化發(fā)酵和傳統(tǒng)自然發(fā)酵，發(fā)酵完成時間為30 d，脆度和粘度均有提高，感官品評結果最好。

2.4 單因素試驗結果分析

2.4.1 接種量試驗結果分析

圖3 榨菜腌制過程中細胞濃度變化Fig.3 Changes of cell concentration duringpickle salting process

由圖3可知，乳酸菌發(fā)酵榨菜的細胞濃度均高于不接種乳酸菌榨菜，但發(fā)酵15 d后，榨菜鹵水的細胞濃度增長變緩，其中接種量為6‰的榨菜細胞濃度最高。

圖4 榨菜發(fā)酵過程中酸度變化曲線Fig.4 The curves of acidity changes duringpickle salting process

由圖4可知，乳酸菌的添加降低了榨菜鹵水的pH，其中接種量為6‰的條件下，鹵水的pH值下降最快，發(fā)酵結束時pH低至4以下。

表3 感官品評得分Table 3 Sensory evaluation score

由表3可知，發(fā)酵榨菜感官評分更優(yōu)的榨菜為6‰條件下的低鹽發(fā)酵榨菜。結合pH、細胞濃度和感官評分3項指標，接種量為6‰的榨菜表現(xiàn)出較好的特性。

2.4.2 混菌接種比例試驗結果分析

圖5 榨菜腌制過程中細胞濃度變化Fig.5 Changes of cell concentration duringpickle salting process

由圖5可知，植物乳桿菌∶漢遜酵母比例為1∶1、0∶3、3∶0的條件下榨菜鹵水均有較高的細胞濃度，但比例在1∶1時，細胞濃度增長速率較快，能較好地抑制其他有害微生物的生長繁殖。

圖6 榨菜發(fā)酵過程中酸度變化曲線Fig.6 The curves of acidity changes duringpickle salting process

由圖6可知，接入發(fā)酵菌的榨菜鹵水pH值在發(fā)酵5 d后均有明顯的降低，隨著發(fā)酵時間的延長，混菌比例為1∶1的榨菜鹵水pH值較低，發(fā)酵20 d后pH降至4以下。

表4 感官品評得分Table 4 Sensory evaluation score

由表4可知，混菌比例為1∶1的榨菜感官評分較高。結合pH、細胞濃度和感官評分3項指標，混菌比例為1∶1的榨菜表現(xiàn)出較好的特性。

2.4.3 白酒添加量試驗結果分析

榨菜的發(fā)酵過程伴隨著酒精發(fā)酵，其后熟階段，由于酒精的酯化作用，促使產品產生獨特的風味物質。酒精也能產生較高的滲透壓，有較強的殺菌和保藏能力。為了提高榨菜的防腐能力和增加榨菜的風味物質，減少榨菜中防腐劑的使用，在榨菜中加入適量白酒，探索其對榨菜品質的影響。

圖7 榨菜腌制過程中細胞濃度變化Fig.7 Changes of cell concentration duringpickle salting process

由圖7可知，發(fā)酵榨菜的細胞濃度隨著白酒添加量的增加而降低，白酒添加量為1%和3%時能保持較高的細胞濃度；當白酒添加量為5%時，菌體生長明顯受到抑制，不利于發(fā)酵的進行。

圖8 榨菜發(fā)酵過程中酸度變化曲線Fig.8 The curves of acidity changes during pickle salting process

由圖8可知，榨菜鹵水的pH隨著白酒添加量的增加而降低，白酒添加量為0%、1%、3%、5%時，榨菜發(fā)酵后期pH值均較低，但5%白酒添加量的榨菜pH值在發(fā)酵10～35 d時較高。

表5 感官品評得分Table 5 Sensory evaluation score

由表5可知，白酒添加量為3%時，榨菜的感官評分較高。結合pH、細胞濃度和感官評分3項指標，添加3%白酒的榨菜品質最好。

2.4.4 氯化鈣添加量試驗結果分析

加入氯化鈣，榨菜中的果膠酸與氯化鈣中的鈣離子結合生成不溶性的鈣鹽，從而提升榨菜的脆度，緩解成品榨菜軟化等問題；但添加過量的氯化鈣會造成低鹽榨菜口味變苦、含水量降低、氯離子過量等不良影響。

圖9 榨菜腌制過程中細胞濃度變化Fig.9 Changes of cell concentration duringpickle salting process

由圖9可知，隨著氯化鈣添加量的增加，榨菜中的細胞濃度受到一定的抑制，特別是當氯化鈣的添加量為0.4%和0.55%時，最終的細胞濃度降至0.2左右。

圖10 榨菜發(fā)酵過程中酸度變化曲線Fig.10 The curves of acidity changes duringpickle salting process

由圖10可知，氯化鈣的添加對榨菜的pH影響不顯著。

表6 感官品評得分Table 6 Sensory evaluation score

由表6可知，0.25%氯化鈣的榨菜成品感官評分較好。結合上述3種指標，選取0.25%氯化鈣加入榨菜發(fā)酵中。

2.5 正交試驗結果分析

2.5.1 正交試驗結果

根據(jù)低鹽榨菜發(fā)酵工藝流程，采用正交試驗設計方法優(yōu)化發(fā)酵條件，結果見表7。由直觀分析法可知幾種發(fā)酵條件對低鹽榨菜感官質量的影響順序為：接種量>白酒添加量>混菌比例(植物乳桿菌∶漢遜酵母)；最優(yōu)的發(fā)酵條件為A2B2C1，即6‰接種量、混菌比例1∶1、白酒添加量2%。

表7 正交試驗結果分析Table 7 Analysis of orthogonal experimental results

2.5.2 方差分析

表8 影響榨菜感官評分方差分析表Table 8 Variance analysis table of sensory score of pickle

通過方差分析各因素對正交試驗的影響，由表8可知，接種量對低鹽榨菜的感官質量有顯著性的影響(P<0.05)，而混菌比例和白酒添加量對低鹽榨菜的感官質量影響不顯著。

2.5.3 驗證試驗

選擇混菌強化低鹽榨菜發(fā)酵，加鹽量為6%，氯化鈣添加量為0.25%，當菌體濃度達到108CFU/mL時噴灑接種至榨菜中。以榨菜含鹽量、氨基酸態(tài)氮、蛋白質、還原糖、亞硝酸鹽等指標對比分析優(yōu)化后低鹽榨菜與傳統(tǒng)榨菜的品質，結果見表9。

表9 強化發(fā)酵與傳統(tǒng)自然發(fā)酵榨菜指標對比Table 9 Quality indexes comparison of pickles by enhanced fermentation and traditional natural fermentation

由表9可知，強化發(fā)酵榨菜發(fā)酵周期明顯縮短，氨基酸態(tài)氮含量高于傳統(tǒng)自然發(fā)酵產品，且其亞硝酸鹽含量明顯降低，脆度和感官評分顯著提升。強化發(fā)酵的低鹽、低pH環(huán)境以及植物乳桿菌的接入對腌制榨菜亞硝酸鹽的產生有一定抑制作用，使榨菜的亞硝酸鹽控制在較低的水平[16]。

3 結論

本試驗選取植物乳桿菌和漢遜酵母作為發(fā)酵菌強化低鹽榨菜發(fā)酵，與植物乳桿菌單菌強化發(fā)酵組相比，混菌強化發(fā)酵組風味多樣，其感官品質優(yōu)于自然發(fā)酵組。經(jīng)過單因素試驗和正交優(yōu)化試驗，得到最優(yōu)發(fā)酵條件：6‰接種量、混菌比例(植物乳桿菌∶漢遜酵母)1∶1、白酒添加量2%、發(fā)酵28 d。該條件下生產的低鹽榨菜產品的蛋白質、還原糖含量與傳統(tǒng)自然發(fā)酵制品無明顯差異，氨基酸態(tài)氮含量高于傳統(tǒng)自然發(fā)酵，而亞硝酸鹽含量則明顯降低，這一結論與He等[17]、曾凡坤等[18]的研究結果一致。付曉紅等在混菌接種發(fā)酵對低鹽榨菜的影響中發(fā)現(xiàn)混菌接種發(fā)酵榨菜的感官品質優(yōu)于自然發(fā)酵榨菜[19]，本試驗驗證結果表明，優(yōu)化條件發(fā)酵制品各項質量指標均優(yōu)于傳統(tǒng)自然發(fā)酵制品，產品質量穩(wěn)定，脆度高，感官評價也較好?；炀鷱娀l(fā)酵研究為直投式發(fā)酵劑的研制提供了生產工藝參數(shù)，對低鹽榨菜行業(yè)的發(fā)展有較積極的指導意義。