張二康，王修俊*，王紀(jì)輝，馮廷萃

(1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)發(fā)酵工程與生物制藥省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025；3.鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣名城食品廠，貴州 鎮(zhèn)遠(yuǎn) 557700)

泡菜又被稱為腌漬菜、發(fā)酵蔬菜，是以新鮮蔬菜作為原料，利用乳酸菌產(chǎn)酸，輔以低鹽和其他香辛料，置于密封厭氧環(huán)境下泡制而成的一種發(fā)酵制品[1,2]，泡菜保存了原料蔬菜中大部分的營(yíng)養(yǎng)成分[3-5]，因其制作過(guò)程中使用的香辛料中某些成分的存在，使之一定程度上具有預(yù)防疾病、抗癌癥、抗腫瘤的功能[6-8]，但是在現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)化發(fā)展過(guò)程中仍然存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、質(zhì)量參差不齊、亞硝酸鹽積累等問(wèn)題[9]。因此如何能使發(fā)酵過(guò)程可控化，縮短發(fā)酵周期，提高產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性，減少發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量，已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究重點(diǎn)[10]。

現(xiàn)有的研究表明，人工接種乳酸菌菌株進(jìn)行泡菜發(fā)酵，其亞硝酸鹽含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于不接種發(fā)酵[11,12]，尤其是進(jìn)行復(fù)合菌株發(fā)酵泡菜，能有效降低亞硝酸鹽的峰值[13,14]；乳酸菌能阻斷亞硝酸鹽的生成，并對(duì)亞硝酸鹽實(shí)施降解[15-17]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，通過(guò)乳酸菌劑發(fā)酵蔬菜對(duì)亞硝酸鹽進(jìn)行降解不失為一個(gè)解決問(wèn)題很好的突破口。

試驗(yàn)以蘿卜為原料，接種乳酸菌劑，強(qiáng)化乳酸發(fā)酵，通過(guò)研究不同因素對(duì)乳酸菌劑發(fā)酵蘿卜的影響，找出發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽降解的最優(yōu)發(fā)酵工藝，以期為蔬菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽降解及控制提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蘿卜：貴陽(yáng)市花溪區(qū)吉林村農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；白砂糖：食用級(jí)，武漢成達(dá)食品有限公司；食鹽：食用級(jí)，四川久大制鹽有限公司。

蛋白胨、牛肉膏(均為生化試劑)：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母膏(生化試劑)：上海博微生物科技有限公司；葡萄糖、硫酸鎂、硫酸錳、乙酸鈉(均為分析純)：成都金山化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鉀(分析純)：天津市大茂化學(xué)試劑廠；檸檬酸氫二銨(分析純)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

乳桿菌屬(Lactobacillusplantarum，LP)、腸膜明串珠菌屬(Leuconostocmesenteroides，LM)：貴州大學(xué)發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

LS-1F型凈化工作臺(tái) 上海索譜儀器有限公司；XFS-280A型手提式壓力蒸汽滅菌鍋 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；722型分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝路線

1.2.2 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)文獻(xiàn)[10]從5 μg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液中吸取0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用溶液于25 mL具塞比色管中，加入2 mL對(duì)氨基苯磺酸溶液(4 g/L)，混勻后靜置3～5 min后再加入1 mL鹽酸萘乙二胺(2 g/L)，加水至刻度，混勻，靜置15 min，用2 cm玻璃比色皿，以空白為對(duì)照值，于波長(zhǎng)538 nm處，以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)來(lái)測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取10.000 g經(jīng)過(guò)勻漿的樣品于50 mL燒杯中，加入30 mL去離子水、2.5 mL飽和硼酸鈉、6 mL 2% NaOH溶液，然后將其放入65 ℃的恒溫水浴鍋中水浴15 min，待其冷卻后，將其轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中定容、混勻、靜止30 min，過(guò)濾得到濾液，吸取濾液5 mL于25 mL具塞比色管中，加入2 mL對(duì)氨基苯磺酸，混勻、靜置3～5 min后，再加入1 mL鹽酸萘乙二胺混勻，加水稀釋至刻度，靜置15 min。將濾液于波長(zhǎng)538 nm處以空白液的吸光度值為0，讀出待測(cè)液的吸光度值。

式中：X1為試樣中亞硝酸鹽(以亞硝酸鈉計(jì))的含量(mg/kg)；A1為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的被測(cè)試樣中亞硝酸鈉的含量(μg)；m為試樣質(zhì)量(g)；V1為測(cè)定用樣液體積(mL)；V0為試樣處理液總體積(mL)。

1.2.4 復(fù)合菌劑配比對(duì)亞硝酸鹽含量影響的研究

將乳桿菌屬(LP)和腸膜明串珠菌屬(LM)2株乳酸菌進(jìn)行活化培養(yǎng)后按表1的菌種配比，其中食鹽添加量為4%，接種量為4%，30 ℃恒溫發(fā)酵，每隔24 h測(cè)定一次發(fā)酵蘿卜中的亞硝酸鹽含量，研究復(fù)合菌劑配比對(duì)亞硝酸鹽的影響，篩選出最佳菌種配比。

表1 發(fā)酵菌種組合的篩選方法Table 1 Screening methods of fermentation strains' combination

1.2.5 蔗糖添加量對(duì)亞硝酸鹽含量影響的研究

根據(jù)1.2.4確定的復(fù)合菌劑最佳配比，試驗(yàn)選用0.5%、0.9%、1.3%、1.7%、2.1% 5個(gè)蔗糖濃度梯度來(lái)進(jìn)行研究，其中食鹽添加量為4%，復(fù)合菌劑接種量為4%，發(fā)酵溫度為30 ℃，以亞硝酸鹽含量為指標(biāo)，來(lái)研究蔗糖添加量對(duì)亞硝酸鹽含量的影響。

1.2.6 食鹽添加量對(duì)亞硝酸鹽含量影響的研究

根據(jù)1.2.4確定的復(fù)合菌劑最佳配比，試驗(yàn)分別以1%、3%、5%、7%、9% 5個(gè)食鹽濃度梯度進(jìn)行研究，其中復(fù)合菌劑接種量為4%，蔗糖添加量為0.7%，發(fā)酵溫度為30 ℃，以亞硝酸鹽含量為指標(biāo)，研究食鹽添加量對(duì)亞硝酸鹽含量的影響。

1.2.7 復(fù)合菌劑接種量對(duì)亞硝酸鹽含量影響的研究

根據(jù)1.2.4確定的復(fù)合菌劑最佳配比，試驗(yàn)分別以2%、4%、6%、8%、9% 5個(gè)接種量梯度進(jìn)行研究，其中食鹽添加量為4%，蔗糖添加量為0.7%，發(fā)酵溫度為30 ℃，以亞硝酸鹽含量為指標(biāo)，研究復(fù)合菌劑接種量對(duì)亞硝酸鹽含量的影響。

1.2.8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽含量影響的研究

根據(jù)1.2.4確定的復(fù)合菌劑最佳配比，試驗(yàn)分別以24，48，72，96，120，144 h 6個(gè)時(shí)間梯度進(jìn)行研究，其中食鹽添加量為4%，蔗糖添加量為0.7%，復(fù)合菌劑接種量為4%，發(fā)酵溫度為30 ℃，以亞硝酸鹽含量為指標(biāo)，研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽含量的影響。

1.2.9 發(fā)酵溫度對(duì)亞硝酸鹽含量影響的研究

根據(jù)1.2.4確定的復(fù)合菌劑最佳配比，試驗(yàn)分別以22，26，30，34，38 ℃ 5個(gè)溫度梯度進(jìn)行研究，其中食鹽添加量為4%，蔗糖添加量為0.7%，復(fù)合菌劑接種量為4%，以亞硝酸鹽含量為指標(biāo)，研究發(fā)酵溫度對(duì)亞硝酸鹽含量的影響。

1.2.10 發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽降解工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了研究不同因素對(duì)發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽含量的影響，篩選出降解亞硝酸鹽最優(yōu)的發(fā)酵工藝參數(shù)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)選取蔗糖添加量(A)、食鹽添加量(B)、復(fù)合菌劑接種量(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)、發(fā)酵溫度(E)5個(gè)因素按L16(45)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以亞硝酸鹽含量為指標(biāo)對(duì)發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽降解工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表2。使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用極差分析確定亞硝酸鹽降解的最佳發(fā)酵工藝。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 自然發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽含量變化

按照1.2.3的試驗(yàn)方法對(duì)自然發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽含量進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 自然發(fā)酵蘿卜亞硝酸鹽含量的變化Fig.1 The change of nitrite content in natural fermented radish

由圖1可知，發(fā)酵蘿卜在0～24 h亞硝酸鹽含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，發(fā)酵24 h時(shí)，亞硝峰出現(xiàn)，此時(shí)的亞硝酸鹽含量達(dá)到41.41 mg/kg，之后隨著發(fā)酵液的酸度持續(xù)降低，抑制了乳酸菌及其他雜菌的生長(zhǎng)，同時(shí)由于亞硝酸鹽酶降解和酸降解，亞硝酸鹽含量逐漸降低至192 h時(shí)趨于穩(wěn)定，此時(shí)亞硝酸鹽含量為5 mg/kg。

2.2 復(fù)合菌劑配比對(duì)亞硝酸鹽含量的影響

按照1.2.4的試驗(yàn)方法研究復(fù)合菌劑配比對(duì)發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 復(fù)合菌劑配比對(duì)亞硝酸鹽含量的影響Fig.2 The effect of ratios of compound bacterial agent on nitrite content

對(duì)比圖1和圖2，添加菌劑的發(fā)酵組，亞硝峰都遠(yuǎn)低于自然發(fā)酵組，且在72 h時(shí)趨于穩(wěn)定，早于自然發(fā)酵的192 h。這是因?yàn)樘砑泳鷦┑陌l(fā)酵組，加入的菌種在很短的時(shí)間內(nèi)成為發(fā)酵環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌種，大量增殖產(chǎn)酸，抑制了其他雜菌的生長(zhǎng)，加速了亞硝酸鹽的降解。

由圖2可知，復(fù)合菌劑LP∶LM的配比為2∶1時(shí)，泡菜中亞硝酸鹽含量低于其他發(fā)酵組，但其酸味較重，口感遠(yuǎn)不及復(fù)合菌劑配比LP∶LM為1∶2的菌株。所以，從亞硝酸鹽及口感質(zhì)地方面考慮，將復(fù)合菌株配比LP∶LM為1∶2作為最佳菌株配比。

2.3 蔗糖添加量對(duì)亞硝酸鹽含量的影響

按照1.2.5的試驗(yàn)方法研究蔗糖添加量對(duì)發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 蔗糖添加量對(duì)亞硝酸鹽含量的影響Fig.3 The effect of additive amount of sucrose on nitrite content

由圖3可知，隨著蔗糖添加量的增加，亞硝峰及穩(wěn)定后的亞硝酸鹽含量隨之降低，但從整體上而言，蔗糖添加量對(duì)乳酸菌發(fā)酵蔬菜總酸及亞硝酸鹽含量的影響并無(wú)顯著差異，但是會(huì)對(duì)發(fā)酵蔬菜的口感和質(zhì)地產(chǎn)生影響，因此，從亞硝酸鹽和產(chǎn)品風(fēng)味方面考慮，選擇蔗糖添加量為0.5%。

2.4 食鹽添加量對(duì)亞硝酸鹽含量的影響

按照1.2.6的試驗(yàn)方法研究食鹽添加量對(duì)發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 食鹽添加量對(duì)亞硝酸鹽含量的影響Fig.4 The effect of additive amount of salt on nitrite content

由圖4可知，食鹽添加量越大，對(duì)復(fù)合菌株的抑制作用越強(qiáng)，引起發(fā)酵速度減慢，產(chǎn)酸量下降，導(dǎo)致亞硝酸鹽降解緩慢，發(fā)酵72 h后，食鹽添加量為1%、3%、5%的泡菜中亞硝酸鹽含量都在1.0 mg/kg以下，但口感不及5%食鹽添加量的泡菜，所以綜合總酸、亞硝酸鹽及產(chǎn)品口感、質(zhì)地特性，選擇食鹽添加量為5%。

2.5 復(fù)合菌劑接種量對(duì)亞硝酸鹽含量的影響

按照1.2.7的試驗(yàn)方法研究復(fù)合菌劑接種量對(duì)發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 復(fù)合菌劑接種量對(duì)亞硝酸鹽含量的影響Fig.5 The effect of inoculation amount of compoundbacteria agent on nitrite content

由圖5可知，隨著復(fù)合菌劑接種量的增大，亞硝酸鹽的降解速度加快，因?yàn)樵龃蠼臃N量，復(fù)合菌株在短時(shí)間內(nèi)就能迅速生長(zhǎng)繁殖，成為優(yōu)勢(shì)菌株，產(chǎn)生大量有機(jī)酸對(duì)亞硝酸鹽實(shí)施降解，但接種量過(guò)大導(dǎo)致發(fā)酵速度加快，產(chǎn)品酸味重，口感差，因此綜合考慮，選擇復(fù)合菌劑的接種量為6%。

2.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽含量的影響

按照1.2.8的試驗(yàn)方法研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽含量的影響Fig.6 The effect of fermentation time on nitrite content

由圖6可知，在24～72 h，亞硝酸鹽降解迅速，說(shuō)明乳酸菌在此階段繁殖能力強(qiáng)，代謝旺盛，產(chǎn)酸量迅速增加；72 h以后，亞硝酸鹽含量基本趨于穩(wěn)定，說(shuō)明發(fā)酵菌株的生長(zhǎng)受到酸度的抑制。因此綜合考慮，選擇發(fā)酵時(shí)間為72 h。

2.7 發(fā)酵溫度對(duì)亞硝酸鹽含量的影響

按照1.2.9的試驗(yàn)方法研究發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 發(fā)酵溫度對(duì)亞硝酸鹽含量的影響Fig.7 The effect of fermentation temperature on the nitrite content

由圖7可知，在30 ℃和34 ℃時(shí)，亞硝酸鹽降解速度較快，主要是因?yàn)樵诖藴囟确秶鷥?nèi)，乳酸菌繁殖快，迅速成長(zhǎng)為優(yōu)勢(shì)菌群，一方面抑制了部分雜菌的生長(zhǎng)代謝，減少了硝酸鹽還原酶的生成，阻斷了亞硝酸鹽的形成；另一方面生成的乳酸對(duì)亞硝酸鹽進(jìn)行降解，總之泡菜在發(fā)酵過(guò)程中，溫度不能太高也不能過(guò)低，溫度過(guò)高引起發(fā)酵速度過(guò)快，不利于產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)的形成，而且造成丁酸細(xì)菌發(fā)酵導(dǎo)致大量氨的積累，溫度過(guò)低抑制了發(fā)酵菌株的生長(zhǎng)代謝，因此綜合考慮，選擇發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.8 發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽降解工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

試驗(yàn)分別對(duì)蔗糖添加量(A)、食鹽添加量(B)、復(fù)合菌劑接種量(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)和發(fā)酵溫度(E)5個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討各影響因素協(xié)同作用下亞硝酸鹽降解的最優(yōu)工藝，試驗(yàn)選取上述5個(gè)因素，采用L16(45)正交表，以亞硝酸鹽含量為指標(biāo)對(duì)發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽降解工藝進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Table 3 The optimized results of orthogonal test

續(xù) 表

由表3可知，從亞硝酸鹽含量考慮，由極差R2可以得出上述5個(gè)因素中影響亞硝酸鹽含量的因素主次為E>D>B>C>A，即發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間>食鹽添加量>復(fù)合菌劑接種量>蔗糖添加量，最佳的亞硝酸鹽降解工藝為A2B2C3D3E2，通過(guò)SPSS軟件對(duì)各因素進(jìn)行方差分析，得出發(fā)酵溫度(p<0.05)對(duì)亞硝酸鹽含量的影響顯著。

通過(guò)優(yōu)化亞硝酸鹽含量可以得出A2B2C3D3E2組合的接種量過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵速度過(guò)快，不利于發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)的形成，綜合亞硝酸鹽含量，選擇亞硝酸鹽降解的最終發(fā)酵工藝為A2B2C2D2E2，即蔗糖添加量為0.5%、食鹽添加量為4%、復(fù)合菌劑接種量為4%、發(fā)酵時(shí)間為72 h、發(fā)酵溫度為28 ℃，但是正交表中沒(méi)有出現(xiàn)這項(xiàng)組合，因此按最佳亞硝酸鹽降解工藝進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Table 4 The results of verification test

由表4可知，在最佳方案A2B2C2D2E2的降解工藝條件下，測(cè)得發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽含量為0.255 mg/kg。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)LP、LM 2株乳酸菌進(jìn)行單菌株和復(fù)合菌株發(fā)酵單因素試驗(yàn)，最終篩選出復(fù)合菌劑配比LP∶LM為1∶2這一菌株組合作為降解亞硝酸鹽的菌種配比。在復(fù)合菌株最佳配比基礎(chǔ)上，篩選亞硝酸鹽降解的最優(yōu)發(fā)酵工藝為：蔗糖添加量0.5%、食鹽添加量4%、接種量4%、發(fā)酵時(shí)間72 h、發(fā)酵溫度28 ℃。在此發(fā)酵工藝下，把發(fā)酵蘿卜的周期由自然發(fā)酵的192 h縮短至72 h，亞硝酸鹽的含量由自然發(fā)酵的5 mg/kg降低至0.255 mg/kg。

與自然發(fā)酵對(duì)比，添加復(fù)合菌劑、控制發(fā)酵條件縮短了發(fā)酵蘿卜的發(fā)酵周期，降低了發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽的含量，為蔬菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽的降解及控制提供了有效途徑。