吳長(zhǎng)力，陳穎琪，陳桂柳，林夢(mèng)哲，張宏梅

(廣東工業(yè)大學(xué) 生物工程系， 廣州 510006)

亞硝酸鹽廣泛存在于咸魚(yú)、腌制肉類(lèi)和腌制蔬菜中，過(guò)量的亞硝酸鹽除了能與人體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解物結(jié)合生成強(qiáng)致癌物質(zhì)亞硝胺外，還可與血紅蛋白結(jié)合而造成正鐵血紅骯癥，對(duì)人體危害極大。有報(bào)道指出各地區(qū)亞硝酸鹽中毒事件逐年增加，所以食品中亞硝酸鹽的污染情況及其控制已成為食品安全相關(guān)領(lǐng)域研究的一大熱點(diǎn)[1-4]。在食品及其配料的亞硝酸鹽清除方法中，比較有效的降解方法是生物降解法。目前報(bào)道較多的是乳酸菌對(duì)發(fā)酵食品中亞硝酸鹽的降解，如Hashimoto等人在泡菜中添加乳酸菌，發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽含量明顯降低[5]；另外，在發(fā)酵食品如香腸、咸魚(yú)和泡菜中，已篩選出許多能降解亞硝酸鹽的乳酸菌株，如植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、沙克乳桿菌(Lactobacillussakei)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)等[6-8]。有關(guān)乳酸菌降解食品中亞硝酸鹽的研究機(jī)理表明, 這些乳酸菌在生物發(fā)酵后期, 主要通過(guò)亞硝酸還原酶來(lái)降解亞硝酸鹽。該酶是植物硝態(tài)氮同化過(guò)程中的一個(gè)十分重要的酶，所以，獲得來(lái)源豐富和高效的亞硝酸鹽還原酶是實(shí)現(xiàn)食品中亞硝酸鹽降解的重要途徑。

本研究前期在泡菜中分離了一株可高效降解亞硝酸鹽，并通過(guò)菌種鑒定的植物乳桿菌L10(LactobacillusplantarumL10)，在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)基因工程技術(shù)，將植物乳桿菌中獲得的nirS基因?qū)氲酱竽c桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并誘導(dǎo)產(chǎn)生重組亞硝酸鹽還原酶，旨在為該酶在食品安全領(lǐng)域中的實(shí)際應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

MRS培養(yǎng)基:購(gòu)自青島海博技術(shù)有限公司；TaKaRa切膠回收試劑盒、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶(Bam H Ⅰ、Xho Ⅰ)：購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；DL2000 DNA Marker、蛋白質(zhì)分子量Marker、pET-32a(+)表達(dá)載體、大腸桿菌BL21(DE3)：購(gòu)自廣州鼎國(guó)生物科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)所用的植物乳桿菌(LactobacillusplantarumL10)從潮汕泡菜(購(gòu)于廣東揭陽(yáng))中分離篩選所得；大腸桿菌DH5а為實(shí)驗(yàn)室保存菌株；亞硝酸鹽還原酶基因引物序列為[9]：

NF 5′-GCGGATCCATGAGTCAAAGCTTATG-3′(下劃線Bam H Ⅰ酶切位點(diǎn))；

NR 5′-CCGCTCGAGTTAATTCCGTACACTG-3′(下劃線Xho Ⅰ酶切位點(diǎn))。

pET-32a(+)質(zhì)粒重組鑒定引物：

T7：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；

T7t：5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′；

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1nirS基因的克隆

采用SDS-CTAB法提取植物乳桿菌的全基因組DNA，以其為模版用引物NF和NR對(duì)nirS基因進(jìn)行擴(kuò)增：反應(yīng)程序(25 μL)為：90 ℃，4 min；94 ℃，45 s；61 ℃，45 s；72 ℃，1 min；30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。獲得產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)[10]。利用切膠回收試劑盒對(duì)目的基因進(jìn)行純化，純化后的nirS基因與pMD 19-T Vector載體過(guò)夜連接，后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5а感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化菌涂布到含有50 mg/mL Amp、24 mg/mL IPTG和20 mg/mL X-gel的LB平板上[11]進(jìn)行篩選，挑取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。利用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，并用限制酶Bam H Ⅰ和Xho Ⅰ進(jìn)行雙酶切消化鑒定，目的基因純化后送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，所得結(jié)果通過(guò)NCBI網(wǎng)站的Blast進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pMD 19-T-nirS。

1.2.2 表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-nirS的構(gòu)建

將克隆所得質(zhì)粒和質(zhì)粒pET-32a(+)分別用限制酶Bam H Ⅰ和Xho Ⅰ進(jìn)行雙酶切消化：ddH2O 6 μL，質(zhì)粒10 μL，緩沖液2 μL，限制酶Bam H Ⅰ、Xho Ⅰ各1 μL，為20 μL體系，37 ℃酶切6 h，切膠回收純化，用T4 DNA連接酶將酶切后的兩組分連接過(guò)夜，得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5а感受態(tài)細(xì)胞中，然后涂布到含有50 μg/mL Amp的LB平板上，挑取陽(yáng)性菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用T7、T7t引物進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定和凝膠電泳鑒定，所得PCR產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為pET-32a(+)-nirS。

1.2.3 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)

將提取的質(zhì)粒pET-32a(+)-nirS轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，取100 μL轉(zhuǎn)化后的表達(dá)菌株涂布到含50 μg/mL Amp的LB平板上，挑取陽(yáng)性菌株進(jìn)行PCR鑒定；將含質(zhì)粒pET-32a(+)-nirS的菌株以1∶100接種到含有50 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6(大約5 h)，加入誘導(dǎo)劑IPTG使其最終濃度為1 mmol/L，37 ℃中繼續(xù)培養(yǎng)4 h誘導(dǎo)表達(dá)，以未誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)的菌株為陰性對(duì)照。分別取菌液20 mL，于4 ℃，4000 r/min離心10 min收集菌體，用預(yù)冷PBS(pH 7.4)沖洗2遍后重懸，超聲裂解5 min，每次2 s，間隔5 s，功率500 W，于4 ℃，12000 r/min離心10 min，分別收集上清液和沉淀，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)情況。

1.2.4 重組酶的復(fù)性

由實(shí)驗(yàn)1.2.3的結(jié)果可知，目的蛋白以包涵體的形態(tài)表達(dá)[12]，因此需要對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性，才可檢測(cè)其酶活。誘導(dǎo)表達(dá)后的重組細(xì)菌超聲裂解后離心，所得沉淀用預(yù)冷的緩沖液(2 mol/L尿素、0.1 mol/L Na2H2PO4、0.01 mol/L Tris-HCl、0.6% Triton-100)低溫洗滌2遍，離心后沉淀用裂解液(8 mol/L 尿素、0.1 mol/L Na2H2PO4、0.01 mol/L Tris-HCl、pH 8.0)重懸，25 ℃中孵育6 h溶解包涵體，離心后對(duì)上清液進(jìn)行尿素梯度透析復(fù)性：依次將包涵體放在尿素濃度為4 mol/L、2 mol/L和PBS緩沖液(均含1 mmol/L EDTA)中透析8 h[13-15]，最后得到復(fù)性后的目的蛋白。

1.2.5 重組酶的酶活測(cè)定

酶活測(cè)定所需反應(yīng)液的配制：0.1 mol/L Na2HPO4、0.05 mol/L檸檬酸緩沖液(pH 6.0)、0.1 mol/L NaCl、0.01 mol/L Na2S2O4，0.01 mol/L甲基紫精(MV)；重組酶酶活測(cè)定按照體系：80 μL反應(yīng)液、20 μL亞硝酸鈉(100 mg/L)、100 μL適當(dāng)濃度酶液加入到1.5 mL EP管中，于37 ℃反應(yīng)15 min，劇烈震蕩結(jié)束反應(yīng)；沸水浴反應(yīng)3～5 min后低速離心5 min，取100 μL上清液于5 mL比色管中采用格里斯試劑比色法測(cè)定亞硝酸鹽濃度[16]，酶活力計(jì)算公式如下：

式中：Y為酶活力(U/mg，U表示降解1 ng亞硝酸鹽所需要的時(shí)間)；X為降解亞硝酸鹽的量(ng)；t為酶催化時(shí)間(min)；M為參加反應(yīng)的酶液濃度(mg/mL)。

2 結(jié)果

2.1 nirS基因的擴(kuò)增

以植物乳桿菌基因組DNA為模版，經(jīng)PCR技術(shù)擴(kuò)增得到nirS基因，再由1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。在1000～2000 bp之間有明顯單一條帶，與預(yù)期的1500 bp左右目的片段相符[17，18]，PCR產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序后，經(jīng)NCBI比對(duì)確認(rèn)為植物乳桿菌的亞硝酸鹽還原酶基因，大小為1638 bp。

圖1 nirS基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of nirS gene

注：M為10000 bp Marker；1為nirS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 T克隆載體的鑒定

將轉(zhuǎn)化了pMD 19-T-nirS質(zhì)粒的陽(yáng)性菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切消化鑒定，所得產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。酶切消化后的pMD 19-T-nirS質(zhì)粒分成2個(gè)條帶，1000～2000 bp的條帶為nirS基因，而另一條帶為pMD 19-T Vector質(zhì)粒條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，pMD 19-T-nirS克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 T克隆載體雙酶切鑒定Fig.2 Identification of T cloning vector by double enzyme digestion

注：M為10000 bp Marker；1為pMD 19-T-nirS質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物。

2.3 重組質(zhì)粒pET-32a(+)-nirS的鑒定

篩選所得陽(yáng)性菌株重新提取質(zhì)粒，用T7、T7t啟動(dòng)子引物進(jìn)行PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖3。其中可見(jiàn)只有1條條帶在2000 bp左右處，符合預(yù)期結(jié)果，經(jīng)測(cè)序,所得結(jié)果經(jīng)過(guò)NCBI中的Blast進(jìn)行序列比對(duì)后確定含有nirS基因，所以重組質(zhì)粒pET-32a(+)-nirS構(gòu)建成功。

圖3 重組質(zhì)粒pET-32a(+)-nirS的PCR鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET-32a(+)-nirS by PCR

注：M為10000 bp Marker；1為T(mén)7啟動(dòng)子引物PCR結(jié)果。

2.4 重組酶的SDS-PAGE電泳檢測(cè)及酶活測(cè)定

圖4 重組菌株表達(dá)蛋白的SDS-PAGE鑒定Fig.4 Identification of recombinant strain expressed protein by SDS-PAGE

注：M為100 kDa Marker；1為上清液蛋白質(zhì)鑒定；2為沉淀蛋白質(zhì)鑒定。

重組菌株經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)后，對(duì)菌液進(jìn)行超聲波裂解，離心所得上清液及沉淀經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4，上清液并沒(méi)有明顯的蛋白質(zhì)條帶，而沉淀物在75～100 kDa之間有一條明顯條帶，與預(yù)期條帶大小相符，故nirS基因在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)形成包涵體。通過(guò)低濃度尿素梯度稀釋法對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性后，獲得12.37 mg具有酶活力的重組蛋白，并測(cè)得其酶活力為2131.5 U/mg。

3 結(jié)論

亞硝酸鹽還原酶大多為胞內(nèi)酶，現(xiàn)已在高等植物、藻類(lèi)植物和各種微生物中發(fā)現(xiàn)其存在。植物細(xì)胞中，nirS主要存在于葉綠體和非綠色組織中的質(zhì)體中[19]；微生物中，nirS常見(jiàn)于反硝化細(xì)菌中，如：Pseudomonasaeruginosa[20]，AlcaligenesfaecalisS-6等，但這些菌株均可能存在食品安全隱患，來(lái)自食用泡菜中篩選得到的乳酸菌基因組DNA，可在菌株來(lái)源上具有相對(duì)安全保障[21]。

有關(guān)研究表明，利用亞硝酸鹽還原酶來(lái)降解亞硝酸鹽，方法之一是直接將產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶的乳酸菌加入到發(fā)酵產(chǎn)品之中。Peiman Esmaeilzadeh等在發(fā)酵香腸時(shí)分別加入Lactobacillusplantarum，Lactobacillusfermentum和兩種菌混合制成的發(fā)酵劑[22]，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵4 d后，接種了菌株的香腸中亞硝酸鹽含量明顯比自然發(fā)酵的低中，但是，接種了菌株的香腸中，乳酸含量更高且pH值更低，改變了已有的食品品質(zhì)。此外，有人提出從發(fā)酵乳酸菌中分離提純出亞硝酸鹽還原酶后以酶制劑的形式使用。陳浩等將干酪乳桿菌分次誘導(dǎo)發(fā)酵2次后，經(jīng)過(guò)溶菌酶和超聲波破碎后分離提純?cè)撁?，? L發(fā)酵液中純化得到了0.54 mg活性蛋白，比活力為1851.2 U/mg[23]。這種方法的缺點(diǎn)是步驟冗長(zhǎng)，獲得的產(chǎn)量較低。本研究從泡菜中篩選得到高效降解亞硝酸鹽的植物乳桿菌，利用基因工程技術(shù)將植物乳桿菌中的nirS基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，獲得以包涵體形式存在的nirS后，利用低濃度尿素梯度稀釋法進(jìn)行復(fù)性，最后從200 mL發(fā)酵液中得到有活性的粗酶液12.37 mg，比活力為2131.5 U/mg。這種方法具有原料消耗低、快捷、高效以及不會(huì)改變產(chǎn)品風(fēng)味等優(yōu)點(diǎn)。但是，由于亞硝酸鹽還原酶異源表達(dá)后以包涵體形式存在，而包涵體的復(fù)性率都較低，所以今后的研究需要針對(duì)亞硝酸鹽還原酶包涵體的復(fù)性程序進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。