張樹武，徐秉良，劉 佳，石成才

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

土壤鹽漬化已成為一個(gè)世界性問題，可造成作物嚴(yán)重減產(chǎn)，每年由于其造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)10億美元[1-3]。據(jù)報(bào)道，目前地球上已有超過6%的耕地嚴(yán)重受到鹽脅迫的影響，且在干旱和半干旱地區(qū)較為嚴(yán)重[4]。同時(shí)，已有研究表明鹽脅迫能夠引起或造成植物形態(tài)特征、生理和代謝反應(yīng)發(fā)生變化，以及改變植物滲透壓和活性氧反應(yīng)等過程，進(jìn)而導(dǎo)致植物體內(nèi)過氧化脂質(zhì)和抗氧化物質(zhì)失活[5]。因此，急需開發(fā)有效技術(shù)來減輕和降低鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育帶來的負(fù)面影響。Phang等[6]研究表明，傳統(tǒng)育種和轉(zhuǎn)基因技術(shù)曾被廣泛用于耐鹽性植物品種的選育，但是傳統(tǒng)育種存在周期長(zhǎng)和效率低，轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在高成本等問題[7-8]。同時(shí)，目前已有許多學(xué)者嘗試?yán)猛庠椿衔餃p輕非生物脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)造成的負(fù)面影響，如已證明殼聚糖[1]、一氧化氮、硝酸鈣[9]及茉莉酸[10]等能夠顯著改善和提高小麥耐鹽水平，但對(duì)于其機(jī)理目前尚未明確。同時(shí)，隨著近年來在該方面研究的不斷深入，有關(guān)利用植物根際促生細(xì)菌和真菌誘導(dǎo)植物抗非生物脅迫方面已有相關(guān)的報(bào)道，如菌根真菌、根瘤菌、植物根際促生菌和內(nèi)生真菌等能夠改善植物生長(zhǎng)[11]，但有關(guān)高效耐鹽微生物突變菌株紫外誘變選育方面的研究和報(bào)道較少。

木霉菌(Trichodermaspp.)作為土壤中存在的一類真菌，廣泛用于不同種類植物病害的生物防治[12-13]。此外，Mastouri等[14]研究表明在生物和非生物脅迫下，哈茨木霉T22(T.harzianum)菌株能夠提高番茄種子的萌發(fā)率，減輕幼苗的氧化損傷，但是隨著鹽濃度的升高，哈茨木霉T22菌株活性顯著降低，并且由于外界環(huán)境的影響其耐鹽性效果不穩(wěn)定。因此，如何提高木霉菌的耐鹽性已是目前急需解決的一個(gè)問題。

因此，本試驗(yàn)通過利用NaCl溶液模擬鹽協(xié)迫逆境條件，并利用紫外誘變提高和改良深綠木霉(Trichodermaatroviride)T-YM菌株耐鹽性，旨在探明紫外誘變對(duì)深綠木霉T-YM菌株生長(zhǎng)和耐鹽性的影響，將為進(jìn)一步提高其耐鹽性奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)于進(jìn)一步改良和擴(kuò)大木霉菌的應(yīng)用范圍具有重要的實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 深綠木霉T-YM菌株分離于甘肅民勤縣玉米根際鹽堿土壤，并保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試化學(xué)試劑 NaCl分析純AR，無色晶體，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分生孢子懸浮液制備 將預(yù)先分離篩選并保存的深綠木霉T-YM菌株轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。培養(yǎng)6 d后，待其產(chǎn)生大量分生孢子后，向培養(yǎng)基表面加入5 mL無菌水和1滴吐溫-80，洗脫菌落表面分生孢子并將其收集于盛有玻璃珠的120 mL三角瓶中，置于溫度為25℃和轉(zhuǎn)速為200 rpm·min-1恒溫?fù)u床振蕩30 min，使其分生孢子分散均勻，即為分生孢子懸浮液，并經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使其孢子濃度為1×106CFU·mL-1，備用。

1.2.2 深綠木霉T-YM菌株紫外誘變處理 誘變處理前30 min打開紫外燈(10 W)使其功率穩(wěn)定。將配制好的深綠木霉T-YM菌株分生孢子懸浮液(1×106CFU·mL-1)加入經(jīng)滅菌處理的1.5 mL離心管中，每管加入1 mL孢子懸浮液。然后，置于紫外燈(10 W) 10 cm處分別處理0.5、1、3、5 min和7 min。試驗(yàn)以等量未經(jīng)誘變的原始菌株分生孢子懸浮液作為對(duì)照，每個(gè)處理和對(duì)照均重復(fù)6次。

1.2.3 紫外誘變對(duì)深綠木霉T-YM菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 采用單孢分離法，對(duì)經(jīng)紫外誘變處理的深綠木霉T-YM和原始菌株分生孢子懸浮液進(jìn)行單孢分離，然后將分離的單個(gè)孢子接種于PDA平板表面，并置于溫度為25℃，光照為16 h的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理和對(duì)照均重復(fù)6次。培養(yǎng)3 d后，將經(jīng)不同時(shí)間紫外誘變處理后生長(zhǎng)較好的突變菌株，利用打孔器(Ф=5 mm)在其菌落邊緣打取菌餅，并轉(zhuǎn)接于新的PDA培養(yǎng)基，置于溫度為25℃和光照為16 h的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后，采用“十字交叉法”測(cè)量菌落直徑，每隔1 d測(cè)定和觀察1次，并于接種培養(yǎng)7 d時(shí)測(cè)定其產(chǎn)孢量。試驗(yàn)以接種原始菌株作為對(duì)照，每個(gè)處理和對(duì)照均重復(fù)6次。

1.2.4 紫外誘變對(duì)深綠木霉T-YM菌絲生長(zhǎng)的影響 配制相同濃度的原始和誘變后經(jīng)單孢分離且生長(zhǎng)較好的突變菌株分生孢子懸浮液(1×106CFU·mL-1)，并吸取1 mL孢子懸浮液接種于60 mL PDB液體培養(yǎng)基中，置于溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為180 rpm·min-1的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)5 d，并經(jīng)無菌濾紙過濾后收集菌絲。然后，經(jīng)60℃恒溫烘干，計(jì)算其菌絲干重。以接種等量原始菌株孢子懸浮液作為對(duì)照，試驗(yàn)每個(gè)處理和對(duì)照均重復(fù)6次。

1.2.5 紫外誘變對(duì)深綠木霉T-YM菌株耐鹽性的影響 待PDA培養(yǎng)基(每三角瓶120 mL)冷卻到50℃～60℃時(shí)，分別加入NaCl晶體，并使NaCl溶液濃度分別為0、10、20、30、40 mg·mL-1和50 mg·mL-1。充分搖勻后，均勻倒入6個(gè)培養(yǎng)皿中制成平板。然后，將獲得的突變菌株經(jīng)單孢分離并純化培養(yǎng)5 d的菌落經(jīng)滅菌的打孔器(Ф=5 mm)制取菌餅接種于含有不同濃度NaCl溶液的PDA平板中央。將各處理和對(duì)照均置于25℃和16 h光照條件的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，試驗(yàn)以原始菌株作為對(duì)照，每個(gè)處理和對(duì)照均重復(fù)6次。培養(yǎng)2 d后，采用“十字交叉法”測(cè)量菌落直徑，每隔1 d測(cè)定1次，并于培養(yǎng)第7天測(cè)量其產(chǎn)孢量。

待PDB培養(yǎng)基(每三角瓶60 mL)冷卻到50℃～60℃左右時(shí)，分別加入NaCl晶體，并使NaCl溶液濃度分別為0、10、20、30、40 mg·mL-1和50 mg·mL-1。配制相同濃度的原始和誘變后經(jīng)單孢分離并純化的突變菌株分生孢子懸浮液(1×106CFU·mL-1)，并吸取1 mL孢子懸浮液接種于60 mL PDB液體培養(yǎng)基中，置于溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為180 rpm·min-1的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)5 d，并經(jīng)無菌濾紙過濾后收集菌絲。然后，經(jīng)60℃恒溫烘干稱重，計(jì)算菌絲干重。試驗(yàn)以接種等量原始菌株孢子懸浮液作為對(duì)照，試驗(yàn)每個(gè)處理和對(duì)照均重復(fù)6次。

1.2.6 耐鹽性突變菌株復(fù)篩及其耐鹽遺傳穩(wěn)定性測(cè)定 將經(jīng)紫外誘變獲得的耐鹽性較強(qiáng)的深綠木霉T-YM正突變菌株(誘變時(shí)間為0.5 min和NaCl濃度為10 mg·mL-1) 參考1.2.5方法接種于培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并以傳代培養(yǎng)后突變菌株的菌落直徑、產(chǎn)孢量和菌絲干重作為測(cè)定指標(biāo)評(píng)價(jià)其耐鹽遺傳穩(wěn)定性。試驗(yàn)每個(gè)處理和對(duì)照均重復(fù)6次。突變菌株傳代培養(yǎng)菌落直徑測(cè)定時(shí)間以接種培養(yǎng)4 d為1代，共傳代培養(yǎng)10次；產(chǎn)孢量測(cè)定時(shí)間以培養(yǎng)7 d為1代，共傳代培養(yǎng)10次；菌絲干重測(cè)定時(shí)間以培養(yǎng)5 d為1代，共傳代培養(yǎng)10次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 16.0軟件分別進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、圖表繪制和方差分析。采用單因素方差分析和Duncan氏新復(fù)極差法統(tǒng)計(jì)各處理平均數(shù)的差異和進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變對(duì)深綠木霉T-YM菌落生長(zhǎng)的影響

表1表明，紫外誘變處理獲得的深綠木霉T-YM突變菌株在活化培養(yǎng)第1天和第2天時(shí)，在不同誘變時(shí)間下其生長(zhǎng)存在明顯的差異。與野生型菌株相比，突變菌株在培養(yǎng)第1天和第2天時(shí)，當(dāng)誘變時(shí)間為3 min時(shí)能夠顯著提高突變菌株的菌落生長(zhǎng)速度，其生長(zhǎng)速率與對(duì)照相比分別提高了22.45%和12.92%，但當(dāng)紫外誘變時(shí)間為7 min時(shí)，突變菌株菌落生長(zhǎng)速度與對(duì)照相比顯著降低，其生長(zhǎng)速率在誘變處理后培養(yǎng)第1天和第2天時(shí)分別降低30.61%和6.96%。然而，誘變處理培養(yǎng)后第3天，不同誘變時(shí)間下所獲得的突變菌株生長(zhǎng)速率與對(duì)照相比均無顯著差異。

2.2 紫外誘變對(duì)深綠木霉T-YM菌株產(chǎn)孢量和菌絲生長(zhǎng)量的影響

表2表明，與野生型菌株相比，當(dāng)紫外誘變時(shí)間為0.5～5.0 min時(shí)，其對(duì)深綠木霉T-YM突變菌株產(chǎn)孢量和菌絲生長(zhǎng)量均具有顯著促進(jìn)作用，但當(dāng)誘變時(shí)間為7.0 min時(shí)，突變菌株產(chǎn)孢量降低，但與野生型菌株相比差異不顯著。液體培養(yǎng)5 d，當(dāng)紫外誘變時(shí)間為0.5 min和5 min時(shí)，能夠顯著增加深綠木霉T-YM突變菌株菌絲干重，且與對(duì)照相比，其菌絲干重分別增加42.22%和46.67%；液體培養(yǎng)7 d，當(dāng)紫外誘變時(shí)間為3 min時(shí)，突變菌株產(chǎn)孢量增加最為顯著，其產(chǎn)孢量與對(duì)照相比增加 28.82%。

表1 紫外誘變對(duì)深綠木霉T-YM菌落生長(zhǎng)的影響

注：表中數(shù)據(jù)均為6個(gè)重復(fù)的平均值。數(shù)據(jù)后不同字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在P<0.05水平差異顯著，下同。

Note: The data in the
Table are means of six replicates. Different letters in the same column mean significant difference atP<0.05 level by Duncan’s new multiple range test, respectively. The same below.

2.3 NaCl脅迫下紫外誘變對(duì)深綠木霉T-YM菌株生長(zhǎng)速率的影響

表3表明，不同濃度NaCl溶液脅迫下，不同紫外誘變時(shí)間對(duì)深綠木霉T-YM突變菌株菌落生長(zhǎng)均具有明顯的影響。培養(yǎng)4 d時(shí)，不同誘變時(shí)間處理的菌落生長(zhǎng)速度隨著NaCl溶液濃度增加，整體呈降低趨勢(shì)，但與對(duì)照(野生型菌株)相比，在不同濃度NaCl溶液(10～50 mg·mL-1)脅迫下，紫外誘變處理的菌落直徑基本高于野生型菌株。當(dāng)NaCl溶液濃度為0～10 mg·mL-1時(shí)，突變菌株生長(zhǎng)速率與野生型菌株無顯著差異，但當(dāng)NaCl溶液濃度為20～50 mg·mL-1時(shí)，突變菌株生長(zhǎng)速率均顯著高于野生型菌株，且在誘變處理3 min時(shí)，其生長(zhǎng)速率顯著高于其它誘變時(shí)間獲得的突變菌株。

表2 紫外誘變對(duì)深綠木霉T-YM菌絲干重 和產(chǎn)孢量的影響

注：表中數(shù)據(jù)均分別為處理后第5天和第7天時(shí)菌絲生長(zhǎng)量和產(chǎn)孢量的平均值。

Note: The data in the
Table are means of six replicates for the dry weight of mycelia and quantity of spore production at 5 and 7 days after treatment, respectively.

2.4 NaCl脅迫下紫外誘變對(duì)深綠木霉T-YM菌株產(chǎn)孢量的影響

表4表明，與野生型菌株相比，NaCl溶液脅迫下，不同紫外誘變時(shí)間對(duì)深綠木霉T-YM突變菌株的產(chǎn)孢量具有一定程度的影響，而且NaCl溶液濃度對(duì)誘變和野生型菌株的產(chǎn)孢量具有較明顯的影響。當(dāng)NaCl溶液濃度為10～50 mg·mL-1時(shí)，其產(chǎn)孢量隨著NaCl溶液濃度增加顯著降低。當(dāng)誘變時(shí)間為0.5～5.0 min時(shí)，10 mg·mL-1NaCl處理的產(chǎn)孢量顯著高于野生型菌株，但當(dāng)誘變時(shí)間為7.0 min時(shí)，其產(chǎn)孢量顯著低于野生型菌株。當(dāng)NaCl濃度增加至20 mg·mL-1以上時(shí)，原始菌株和突變菌株產(chǎn)孢量均急驟下降。

表3 NaCl脅迫下紫外誘變對(duì)深綠木霉T-YM菌落生長(zhǎng)的影響

注：表中數(shù)據(jù)均為接菌第4天后6個(gè)重復(fù)的平均值。

Note: The data in the
Table are means of six replicates at 4 days after inoculation.

表4 NaCl脅迫下紫外誘變對(duì)深綠木霉T-YM菌株產(chǎn)孢量的影響/(106 CFU·mL-1)

注：表中數(shù)據(jù)均為接菌第7天后6個(gè)重復(fù)的平均值。

Note: The data in the
Table are means of six replicates at 7 days after inoculation.

2.5 NaCl脅迫下紫外誘變對(duì)深綠木霉T-YM菌株菌絲干重的影響

表5表明，與野生型菌株相比，10 mg·mL-1NaCl溶液脅迫下，培養(yǎng)后不同誘變時(shí)間獲得的突變菌株菌絲干重整體高于野生型菌株，尤其誘變時(shí)間為3 min時(shí)增加最為顯著。隨著NaCl溶液濃度增加，突變菌株和野生型菌株菌絲干重呈降低趨勢(shì)。

2.6 NaCl脅迫下紫外誘變對(duì)深綠木霉T-YM菌株耐鹽遺傳穩(wěn)定性的影響

表6為10 mg·mL-1NaCl脅迫下，紫外誘變0.5 min獲得的突變菌株經(jīng)傳代接種培養(yǎng)后的菌落生長(zhǎng)狀況。NaCl脅迫下突變菌株傳代接種培養(yǎng)4 d后，不同代培養(yǎng)菌株間菌落直徑無顯著差異；培養(yǎng)5 d后，不同代培養(yǎng)菌株間菌絲干重?zé)o顯著差異；培養(yǎng)7 d后，不同代培養(yǎng)菌株間產(chǎn)孢量無顯著差異。

表5 NaCl脅迫下紫外誘變對(duì)深綠木霉T-YM菌株菌絲干重的影響/g

注：表中數(shù)據(jù)均為接菌第5天后6個(gè)重復(fù)平均值。

Note: The data in the Table are means of six replicates at 5 days after inoculation.

表6 NaCl脅迫下紫外誘變對(duì)深綠木霉T-YM 菌株耐鹽遺傳穩(wěn)定性的影響

注：表中菌落直徑、產(chǎn)孢量和菌絲干重?cái)?shù)據(jù)均為接菌第4天、第7天和第5天后6個(gè)重復(fù)的平均值。

Note: The data of colony diameter, quantities of spores production, and dry weight of mycelia in the
Table are means of six replicates at 4 days, 7 days, and 5 days after inoculation, respectively.

3 結(jié)論與討論

前期研究表明，高濃度鹽脅迫對(duì)木霉菌生長(zhǎng)速率、菌絲生長(zhǎng)量和產(chǎn)孢量具有一定程度的抑制作用[15-16]，因而，為了獲得具有更強(qiáng)耐鹽性的木霉突變菌株，尋求改良和提高木霉菌耐鹽性的技術(shù)和手段已成為目前研究的一種新趨勢(shì)。據(jù)報(bào)道，改良微生物菌株的手段和方法主要有誘變、遺傳改良和原生質(zhì)體融合等技術(shù)[17-19]，其中誘變技術(shù)是目前應(yīng)用較為廣泛的一種技術(shù)，已被應(yīng)用于多功能木霉菌突變菌株的研究[20]。在現(xiàn)有的誘變技術(shù)中，紫外誘變作為簡(jiǎn)便、實(shí)用和誘變效果明顯的物理誘變因子，已被廣泛應(yīng)用于菌種改良[21]。本試驗(yàn)以鹽堿土分離獲得的1株深綠木霉T-YM菌株為原始菌株進(jìn)行紫外誘變處理，結(jié)果表明當(dāng)誘變時(shí)間為3 min時(shí)能夠顯著提高深綠木霉T-YM菌株的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量，當(dāng)誘變時(shí)間為5 min能夠顯著提高菌絲生長(zhǎng)量。薛應(yīng)鈺等[22]研究表明在紫外照射強(qiáng)度20 W，照射時(shí)間40 min和照射距離30 cm時(shí)獲得的誘變菌株生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量顯著高于野生型菌株，其研究結(jié)果與本試驗(yàn)基本一致，但是其誘變條件與本試驗(yàn)存在差異，其原因可能由于不同微生物對(duì)紫外光的敏感性有所差異，進(jìn)而導(dǎo)致其最佳的誘變條件不一致。

另外，在NaCl溶液模擬鹽脅迫條件下，當(dāng)誘變時(shí)間為0.5～5 min時(shí)，與對(duì)照相比誘變菌落直徑、產(chǎn)孢量和菌絲干重整體高于野生型菌株，且當(dāng)誘變處理時(shí)間為3 min時(shí)，誘變菌株的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量顯著提高，即顯著提高其耐鹽性。Mohamed等[23]研究發(fā)現(xiàn)，通過利用-輻射誘導(dǎo)獲得2株具有穩(wěn)定耐鹽性的哈茨木霉突變體Th50M6和Th50M11，且在鹽脅迫下突變菌株生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量，以及其對(duì)尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)生物防治效果顯著高于野生菌株。同時(shí)，2個(gè)耐鹽性菌株在鹽濃度為0～69 mM的培養(yǎng)基上其菌絲能夠正常生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。另外，已有相關(guān)的研究報(bào)道了利用紫外誘變提高木霉菌的解磷能力和抗藥性。薛應(yīng)鈺等[22]通過紫外誘變獲得一株具備高效解磷能力的木霉突變株T2-8，其解磷能力顯著高于野生型菌株。尹婷等[24]通過紫外光照射獲得了4株對(duì)速克靈抗藥性較強(qiáng)的深綠木霉菌株，但是有關(guān)利用紫外誘變提高木霉菌耐鹽性方面尚未報(bào)道，在今后還有待進(jìn)一步深入研究。

因此，紫外誘變可作為選育高效耐鹽木霉突變菌株的有效方法。同時(shí)，利用植物與鹽漬土中有益微生物的共生關(guān)系緩解鹽漬土對(duì)植物生長(zhǎng)造成的不利影響，可為提高植物的耐鹽性及鹽漬土的生物改良提供一條新思路，但是目前有關(guān)木霉菌耐鹽機(jī)理還有待深入研究。