陳艷通， 侯典海， 楊 曉， 王福悅，趙亞烜， 高媛媛， 林維平*，孫同毅*

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院 護(hù)理學(xué)院，山東 濰坊 261053；3.濰坊醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 濰坊 261053)

藥用真菌是很重要的中藥來源之一，具有降血脂、抗腫瘤、改善機(jī)體免疫力等多種功效[1-2]。真菌能夠在其生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生大量的生理活性物質(zhì)，主要包含黃酮、多酚、多糖、有機(jī)酸、甾體、萜類與多肽等，具有很好的抗腫瘤、抗氧化等活性[3]，且毒副作用較低[4-6]。Zhang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，紅平菇多糖能夠通過增強(qiáng)抗氧化酶活性、清除肝臟中釋放的自由基阻斷氧化鏈反應(yīng)來緩解由四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷，保護(hù)肝臟；Yu等[8]研究發(fā)現(xiàn)香菇菌絲體多糖可通過提高機(jī)體抗氧化能力來緩解由苯酚誘導(dǎo)的大鼠口腔潰瘍，減輕其炎性反應(yīng)?？禎嵉萚9]研究發(fā)現(xiàn)，銀耳多糖可通過降低血小板數(shù)目，減少黏附率，起到抗血栓的作用。靈芝三萜化合物[10]能夠通過激活ERK和JNK促分裂原激活蛋白激酶，促使肝癌細(xì)胞HuH-7凋亡。血紅密孔菌 (Pycnoporussanguineus)是擔(dān)子菌綱、多孔菌科、密孔菌屬的一種白腐真菌[11-12]。具有殺滅細(xì)菌、抑制腫瘤、消炎止血等作用[13-14]。Smnia等[15]研究發(fā)現(xiàn)血紅密孔菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物色素具有抑制革蘭陽(yáng)性菌的作用；駱守鵬[16]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)液態(tài)培養(yǎng)血紅密孔菌色素質(zhì)量濃度為4.32 μg/mL時(shí)，抑菌率高達(dá) 98%。密孔菌可作為食品應(yīng)用于保健品的開發(fā)，也可用于治療皮膚損傷。目前對(duì)血紅密孔菌的研究多集中在木質(zhì)纖維素類原料生物轉(zhuǎn)化方面[17]，而培養(yǎng)條件(光照和pH)對(duì)血紅密孔菌生長(zhǎng)及抗氧化活性影響的研究并不多見。 不同的培養(yǎng)條件尤其是光照和pH，對(duì)真菌生長(zhǎng)，抗氧化能力都有較大影響。楊曉坡等[17]研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)兩周的光照條件及pH 9時(shí)對(duì)真菌多酚含量的影響較大，抗氧化能力達(dá)到最高，約為其他條件的1.2倍和1.5倍。余海尤等[18]發(fā)現(xiàn)，24 h光照條件下，忍冬纖孔菌生物量較低，但DPPH自由基的清除能力相對(duì)較高，約為其他條件的0.6倍和1.2倍；在初始培養(yǎng)液pH分別為5及3條件下，菌絲體生物量和提取物活性均達(dá)到最高，最高可達(dá)其他條件的1.5倍和3倍；Zheng等[19]研究也發(fā)現(xiàn)，光照條件下樺褐孔菌生物量比黑暗中的低，而DPPH自由基清除活性則比黑暗條件下高。生物抗氧化能力主要是清除自由基[20]，目前自由基清除能力分析的常用方法是DPPH法，該法也是評(píng)價(jià)物質(zhì)體外抗氧化活性的重要方法[21-22]。本研究通過對(duì)血紅密孔菌的培養(yǎng)，對(duì)不同光照和pH條件下血紅密孔菌的生物量、DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力進(jìn)行分析，為進(jìn)一步優(yōu)化血紅密孔菌培養(yǎng)條件提供參考，也支持了進(jìn)一步探究其藥理藥效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 血紅密孔菌(Pycnoporussanguineus)，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC 51180)。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①固體PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200，葡萄糖20，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 1,瓊脂20,水1 000 mL，pH自然。②液體PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200，葡萄糖20，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 1,水1 000 mL，pH根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)節(jié)。

1.1.3 主要試劑與儀器 DPPH(Sigma)；T-AOC測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；乙醇、硫酸、苯酚購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司且均為分析純；ZWY-2012C恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)；HPX-9272MBE培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；LYNX4000高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；UV-5500紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)，PowerWave XS酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化與培養(yǎng) 菌種接種于固體PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)接到液體PDA培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)7 d，取出留作后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.2 不同光照與pH條件培養(yǎng) ①光照對(duì)血紅密孔菌的影響：用滅菌后的勻漿器打碎活化后的菌體發(fā)酵液，經(jīng)充分振蕩后以2%的接種量接種到250 mL錐形瓶中(含有100 mL液體PDA培養(yǎng)基，pH自然)，設(shè)置14 d黑暗(D)、14 d光照(L)和1 d黑暗、1 d光照(DL)交替3種光照條件，設(shè)3個(gè)平行，每2 d取樣，于恒溫?fù)u床28 ℃、150 r/min培養(yǎng)。②pH對(duì)血紅密孔菌的影響：用滅菌后的勻漿器打碎活化后的菌體液，經(jīng)充分振蕩后以2%的接種量接種到100 mL液體PDA培養(yǎng)基(已分別調(diào)節(jié)pH至3.0、5.0、7.0、9.0)，28 ℃、150 r/min黑暗條件下培養(yǎng)14 d，設(shè)3個(gè)平行，每隔2 d取樣檢測(cè)。

1.2.3 菌體及上清收集 每2 d取樣，8 000 r/min離心15 min；收集菌體60 ℃烘干至恒重，稱量記錄不同培養(yǎng)條件下菌體生物量，生物量(g/L)=菌絲體干重(g)/發(fā)酵液體積(L)；收集上清液用于DPPH自由基清除能力檢測(cè)、胞外T-AOC含量檢測(cè)。

1.2.4 總抗氧化能力檢測(cè) 采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。待測(cè)樣品分為測(cè)定管與對(duì)照管，測(cè)定管中依次加入相關(guān)試劑及待測(cè)樣品；對(duì)照管中除不加入待測(cè)樣品外，其余同測(cè)定管一致。37 ℃充分反應(yīng)30 min后，各加入顯色劑(對(duì)照管中另加入待測(cè)樣品)分別充分混勻；于520 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定各管吸光度值。總抗氧化能力計(jì)算公式：

總抗氧化能力(U/mL)=

1.2.5 DPPH自由基清除能力檢測(cè) 收集不同培養(yǎng)條件下的上清各100 μL于96孔板中，并向每孔中加入100 μL 2.0×10-4mol/L的DPPH溶液，混勻后室溫避光放置30 min，于517 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光值，清除率計(jì)算公式：

清除率(%)=(1-(Ai-Aj)/A0)×100%

式中：Ai為DPPH溶液與樣品混合后溶液的吸光值；Aj為樣品溶液的吸光值；A0為DPPH溶液的吸光值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得的結(jié)果數(shù)值均以平均值及標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)用 SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照及pH條件對(duì)血紅密孔菌生長(zhǎng)過程中生物量變化的影響

2.1.1 光照 不同光照培養(yǎng)條件下，血紅密孔菌生物量均基本呈上升趨勢(shì)(圖1)。14 d光照條件下，生物量先上升至第8天為2.68 g/L，于第10天有所下降，后又升至2.92 g/L(第12天)，后于第14天略降至2.28 g/L;1 d光照1 d黑暗交替條件下，生物量于第2～12天略有升高，并在第14天最終達(dá)到2.94 g/L;14 d黑暗條件下，第2～10天血紅密孔菌的生物量處于緩慢上升狀態(tài)，并于第10天～12天生物量大幅上升，隨后緩慢上升并于第14天達(dá)到最大值，為4.49 g/L。 綜上所述，14 d黑暗條件更利于血紅密孔菌的生長(zhǎng)，于第10～14天生長(zhǎng)過程中，其生物量均明顯高于14 d光照組及14 d光照黑暗交替組且差異顯著。

圖1 不同光照條件對(duì)血紅密孔菌生物量的影響Fig.1 Effects of different light conditions on the biomass of Pycnoporus sanguineus

2.1.2 pH值 在血紅密孔菌的生長(zhǎng)過程中，不同pH條件對(duì)其生物量的影響較大(圖2)。當(dāng)pH為3時(shí)，生物量于第4天達(dá)到最大值4.89 g/L，后續(xù)保持基本平穩(wěn)狀態(tài)；當(dāng)pH為5時(shí)，生物量一直上升至第10天，達(dá)最大值7.12 g/L，隨后略有下降，第14天下降至6.49 g/L；當(dāng)pH為7時(shí)，生物量從第2～4天保持平穩(wěn)，從第4～12天處于上升狀態(tài)，于第12天達(dá)最大值5.70 g/L，隨后有所下降，降至5.48 g/L；當(dāng)pH為9時(shí)，生物量從第2～14天基本保持升高，并于第14天達(dá)最大值6.19 g/L。 綜上所述，pH為5時(shí)，血紅密孔菌的生物量增長(zhǎng)最大且后期(第8～14 天)較其余3組增長(zhǎng)明顯。因此，pH 5更適于該菌的生長(zhǎng)。

圖2 不同pH條件對(duì)血紅密孔菌培養(yǎng)過程中生物量的影響Fig.2 Effects of different pH conditions on the biomass of Pycnoporus sanguineus

2.2 不同光照及pH條件對(duì)血紅密孔菌培養(yǎng)過程中DPPH自由基清除能力變化的影響

2.2.1 光照 不同光照下，血紅密孔菌液體培養(yǎng)過程中DPPH自由基清除能力的變化趨勢(shì)大致相同(圖3)。14 d光照培養(yǎng)下，血紅密孔菌對(duì)DPPH自由基清除能力從第2天迅速上升至第4天達(dá)到最大值60.73%，到第6天降為40.41%，直到第12天達(dá)到57.54%，第14天下降至50.99%；1 d光照、1 d黑暗交替條件下，DPPH自由基清除能力在第2天達(dá)到最大值71.28%，之后迅速下降，于第6天降至42.77%，接下來的4 d先上升至49.70%(第8天)后下降最低值41.09%(第10天)，最后4 d出現(xiàn)增高，并于第14天達(dá)到64.58%；14 d黑暗培養(yǎng)下，DPPH自由基清除率的變化與1 d光照、1 d黑暗交替培養(yǎng)大致相同，于第4天達(dá)到最大值67.75 %，于第6天降至最低值32.22%，第6～14 天較平穩(wěn)上升，并于第14天上升至62.23%。上述結(jié)果說明，相較于14 d光照和14 d黑暗條件，14 d光照、黑暗交替條件更利于血紅密孔菌對(duì)DPPH自由基的清除，并于第2天達(dá)到峰值，為71.28%。

圖3 不同光照條件對(duì)血紅密孔菌DPPH自由基清除能力的影響Fig.3 Effects of different light conditions on the DPPH radicals scavenging activities of Pycnoporus sanguineus

2.2.2 pH值 在血紅密孔菌生長(zhǎng)過程中，不同pH值對(duì)其DPPH自由基清除率的變化影響較大(圖4)。當(dāng)pH為3時(shí)，DPPH自由基清除率從第2天緩慢上升至第12天，并達(dá)到最大值85.96%，于第14天下降至48.46%；當(dāng)pH為5時(shí)，DPPH自由基清除率先波動(dòng)后下降，總體處于較低水平，最終降至43.75%；當(dāng)pH為7時(shí)，DPPH自由基清除率由第2天的86.83%下降至第4天 70.96%，隨后緩慢上升并于第10天達(dá)最大值94.99%，隨后下降，最終降至79.55%；當(dāng)pH為9時(shí)，血紅密孔菌對(duì)DPPH自由基的清除率一直處于波動(dòng)狀態(tài)，在第6天達(dá)最大值93.97%，隨后處于下降趨勢(shì)，最終于第14天降至69.73%。綜上所述，pH為7時(shí)得到的DPPH自由基清除率峰值與其他3組相比最高，為94.99%，其次是pH 9?？梢娖珘A(pH 9和pH 7)條件下，血紅密孔菌對(duì)DPPH自由基的清除能力較高。

圖4 不同pH條件對(duì)血紅密孔菌DPPH自由基清除能力的影響Fig.4 Effects of different pH conditions on the DPPH radicals scavenging activities of Pycnoporus sanguineus

2.3 不同光照及pH條件對(duì)藥用真菌培養(yǎng)過程中總抗氧化能力(T-AOC)變化的影響

2.3.1 光照 不同光照條件對(duì)血紅密孔菌培養(yǎng)過程中總抗氧化能力變化的影響較大(圖5)。14 d光照條件下，血紅密孔菌T-AOC在前10 d的生長(zhǎng)過程中緩慢升高，于第2天的4.77 U/mL上升至11.92 U/mL，隨后的第12～14天 T-AOC含量波動(dòng)較大，分別在第12天下降至7.34 U/mL，在第14天升高至12.52 U/mL；在1 d光照、1 d黑暗條件下，真菌總抗氧化能力的變化呈“W”型變化，于第2天 6.72 U/mL下降至第4天的 5.63 U/mL，然后平穩(wěn)提高至第8天 13.01 U/mL，接下來的4 d培養(yǎng)過程中，T-AOC下降至9.00 U/mL，最后的2 d T-AOC增強(qiáng)，并于第14天達(dá)到最高值14.18 U/mL；14 d黑暗條件培養(yǎng)下，真菌T-AOC在前10 d呈較緩慢的上升趨勢(shì)，由第2天的5.39 U/mL緩慢上升至第10天的13.40 U/mL，隨后在第10～12天的培養(yǎng)過程中，T-AOC迅速上升至25.10 U/mL，到第14天出現(xiàn)較小程度的降低，此時(shí)真菌T-AOC為23.39 U/mL。 總體而言，3種光照培養(yǎng)條件下，T-AOC的最大值出現(xiàn)在14 d黑暗培養(yǎng)的第12天，為25.10 U/mL，較其他兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，黑暗條件下有助于增強(qiáng)血紅密孔菌的總抗氧化能力。

圖5 不同光照條件對(duì)血紅密孔菌總抗氧化能力的影響Fig.5 Effects of different light conditions on the total antioxidant capacities of Pycnoporus sanguineus

2.3.2 pH值 不同pH條件對(duì)血紅密孔菌培養(yǎng)過程中總抗氧化能力變化的影響較大(圖6)。當(dāng)pH為3和5時(shí)，血紅密孔菌總抗氧化能力變化趨勢(shì)基本一致，始終維持在較低水平(10 U/mL以下)；當(dāng)pH為7時(shí)，總抗氧化能力從第4天開始迅速增加至第10天，并達(dá)最大值64.34 U/mL，隨后逐步下降，在第14天降至47.69 U/mL；當(dāng)pH為9時(shí)，總抗氧化能力從第6天快速上升，并于第8天上升至最大值62.49 U/mL，隨后快速下降至25.9 U/mL(第12天)，然后維持基本不變。綜上所述，偏酸環(huán)境對(duì)血紅密孔菌抗氧化能力基本沒有影響，而中性及偏堿環(huán)境對(duì)其影響較大，且對(duì)比偏酸環(huán)境差異顯著。因此，中性及偏堿性環(huán)境更能提高血紅密孔菌的總抗氧化能力。

圖6 不同pH條件對(duì)血紅密孔菌總抗氧化能力的影響Fig.6 Effects of different pH conditions on the total antioxidant capacities of Pycnoporus sanguineus

3 討 論

在不同的培養(yǎng)條件下，光照和pH值是真菌發(fā)酵過程中最重要的環(huán)境因素[23-24]，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、產(chǎn)物的合成都有重要影響，進(jìn)而影響其產(chǎn)量和抗氧化活性[25-26]。本研究通過測(cè)定血紅密孔菌培養(yǎng)過程中的生物量、DPPH自由基清除能力、T-AOC，探索了光照和pH對(duì)血紅密孔菌生長(zhǎng)及抗氧化活性的影響，為進(jìn)一步研究和利用血紅密孔菌提供參考。

研究表明，不同光照和pH條件對(duì)血紅密孔菌培養(yǎng)過程中生物量、DPPH自由基清除率、T-AOC和多糖含量都有差異，但其影響程度不同?？傮w而言，黑暗環(huán)境更利于血紅密孔菌的生長(zhǎng)以及抗氧化活性的增強(qiáng)，且二者的增長(zhǎng)趨勢(shì)比較一致。相對(duì)于14 d光照和1 d光照、1 d黑暗交替的光照條件，血紅密孔菌在14 d黑暗環(huán)境中有最大生物量，為4.49 g/L，是其他光照條件的1.5倍，同時(shí)中間生長(zhǎng)過程伴隨有基質(zhì)的大量消耗；T-AOC于第12天達(dá)到最高值25.10 U/mL。不同pH條件對(duì)血紅密孔菌培養(yǎng)過程中各項(xiàng)指標(biāo)影響有一定差異。偏酸環(huán)境更適于血紅密孔菌的生長(zhǎng)，但中性和偏堿環(huán)境抗氧化能力較高[27]。當(dāng)pH為5時(shí)血紅密孔菌在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的生物量在第10天達(dá)到最大值，為1.69 g/L。而DPPH自由基清除能力和T-AOC的最高值均出現(xiàn)在pH 7時(shí)，于第10天分別達(dá)到94.99 %和64.34 U/mL。本研究初步分析了光照和pH值對(duì)血紅密孔菌的生長(zhǎng)與抗氧化能力的影響，為相關(guān)研究的細(xì)致分析，以及為分離分析該菌的抗氧化生理活性物質(zhì)等相關(guān)工作提供參考，以促進(jìn)開發(fā)和利用該菌的藥用價(jià)值。