馬業(yè)菲，付小芬，于麗平，何 文，高 燕，褚然然

(齊魯理工學(xué)院,山東 濟南 250200)

葡萄糖是人體內(nèi)不可缺少的一種物質(zhì)，直接影響人體內(nèi)的新陳代謝。近年來，糖尿病的發(fā)病率在全球一直呈現(xiàn)上升狀態(tài)。糖尿病已經(jīng)成為威脅人類健康的一種疾病。

因此，對于糖尿病患者來說早診斷、早治療是十分重要的，實時快速監(jiān)測糖尿病人血液中葡萄糖的含量對控制病情具有非常重要的意義。近年來，文獻報道了很多檢測葡萄糖的新方法，如熒光法[1]，電化學(xué)法[2]，色譜法[3]，等。熒光法具有靈敏度高、檢出線低等優(yōu)點，但成本高、應(yīng)用范圍??；電化學(xué)法具有靈敏度高、準確度高等優(yōu)點，但選擇性差；色譜法具有分離效率高、選擇性好、檢測靈敏度高等優(yōu)點，但分析成本高。所以發(fā)展一種較為簡便的葡萄糖檢測新方法具有十分重要的意義。

分光光度法由于簡單、快速、無需昂貴的分析儀器、可進行可視化檢測等優(yōu)勢而備受青睞。但多數(shù)依賴于金納米粒子[4]、氧化鈰納米粒子[5]，納米粒子合成過程比較復(fù)雜，且一般需要進行水溶性處理，操作復(fù)雜。因此，建立了一種簡便、快速的分光光度法法對葡萄糖的檢測是非常有必要的。該研究以Fe(II)來催化H2O2氧化底物TMB發(fā)生顯色反應(yīng)。有效的避免了其他納米粒子的缺陷，具有成本低、操作方便、快速等優(yōu)點。本研究基于Fe(II)增強了H2O2-TMB反應(yīng)，建立了一種新的分光光度法并用于葡萄糖的檢測。

1 試劑和試劑

1.1 試劑

3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺，氯化亞鐵，葡萄糖，葡萄糖氧化酶，果糖，乳糖，麥芽糖，糖尿病病人的尿液(液)，過氧化氫，三羥甲基氨基甲烷，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，鹽酸。

1.2 儀器

UV-752N型紫外可見分光光度計、UV-1750型紫外可見分光光度計、恒溫水浴鍋。

2 實驗方法

(1)將不同濃度的葡萄糖溶液加入2.0mL離心管中，加入適量的磷酸緩沖溶液(pH值=7.0)，再加入GOD 25μL(終濃度為10-3g/mL)。將水浴鍋逐漸升溫到37℃后把混合液放入水浴鍋中反應(yīng)30 min。

(2)加入30μL TMB(終濃度為2.0×10-3mol/L)、1240μL Tris-HCl緩沖溶液(pH值=5.5)和30μL Fe(II)溶液(終濃度為2.0×10-4mol/L)于上述反應(yīng)液中在2.0mL離心管中混合反應(yīng)，溶液的終體積為1.5mL。反應(yīng)5min后測定體系中葡萄糖的含量。

(3)特異性測定實驗中果糖、乳糖、麥芽糖(終濃度均為8.0×10-3mol/L)代替葡萄糖。

(4)實際樣品中糖尿病患者的尿液50μL代替葡萄糖。

3 結(jié)果與討論

3.1 實驗原理

圖1 葡萄糖檢測反應(yīng)原理圖

如圖1所示，在催化劑Fe(II)的作用下，H2O2產(chǎn)生羥基自由基，進而快速的將TMB氧化成oxTMB并且發(fā)生明顯的顏色變化，且GOD分解葡萄糖產(chǎn)生H2O2。體系在650 nm處的吸光度與葡萄糖的濃度在一定的范圍內(nèi)呈正比。因此，我們可以根據(jù)吸光度的變化對葡萄糖進行分析與檢測。

3.2 可行性驗證

為了驗證本實驗方法的可行性，我們對Fe(II)催化H2O2氧化TMB的催化活性進行探究。如圖2A所示，將不同濃度的Fe(II)加入到含有TMB和H2O2的溶液中，觀察到隨著Fe(II)濃度的增加，顏色越來越深，并且650nm處的吸光度也不斷升高。

該體系利用GOD氧化葡萄糖而產(chǎn)生的H2O2進行實驗，為了保證實驗的可行性，需要進一步驗證。如圖2B所示，在不含葡萄糖的條件下，無H2O2的生成，測定的吸光度很小。在含有GOD和Fe(II)的條件下，加入不同濃度的葡萄糖溶液，可以觀察到隨著葡萄糖含量的增加，吸光度越來越大。結(jié)果表明，該方法可以用于葡萄糖的檢測。

圖2 不同條件下樣品溶液的吸收光譜圖

3.3 實驗條件的優(yōu)化

為了提高實驗的準確性及靈敏度，本實驗對影響葡萄糖測定的主要因素：pH值、溫度、濃度、時間等實驗條件進行了優(yōu)化。

在固定Fe(II)、H2O2和TMB的濃度下，考察了不同pH值的Tris-HCl緩沖溶液對信噪比的影響。結(jié)果表明pH值=5.5的Tris-HCl緩沖溶液信噪比最大。

在固定H2O2和TMB的濃度下，我們設(shè)置一系列不同濃度梯度的Fe(II)溶液去催化TMB發(fā)生顯色反應(yīng)。通過實驗結(jié)果，將2.0×10-4mol/L定為Fe(II)溶液的最佳濃度。

在固定Fe(II)和TMB的濃度下，探究不同濃度的H2O2對吸光度的影響。結(jié)果表明，當濃度達到5.0×10-4mol/L時，吸收峰的峰值基本不再發(fā)生變化，因此我們把5.0×10-4mol/L作為H2O2的最佳濃度。

在固定Fe(II)、H2O2和TMB的濃度下對時間和溫度進行了探究。通過實驗結(jié)果，我們選取最優(yōu)分解時間為30min，最適的反應(yīng)溫度為37℃。

3.4 葡萄糖標準曲線的繪制

圖3 葡萄糖在650nm處標準曲線

在最優(yōu)實驗條件下建立了基于Fe(II)催化的葡萄糖檢測新方法，實現(xiàn)了對于葡萄糖含量的定量檢測。650nm處的吸光度值與葡萄糖濃度在2.0×10-3～1.0×10-2mol/L范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系(圖3)，線性方程為：I = 0.1064C + 0.2248(其中I代表溶液的吸光度值，C代表葡萄糖的濃度(單位為10-3 mol/L))，相關(guān)系數(shù)為R2= 0.9983。

3.5 特異性分析

在本實驗中，我們?yōu)榱蓑炞C葡萄糖比色檢測方法的可靠性，選擇了葡萄糖類似物果糖、乳糖、麥芽糖來作為干擾對象進行分析檢測。結(jié)果表明葡萄糖有明顯的信號反應(yīng)，在650nm處吸光度比較大，而其他糖類基本沒有信號反應(yīng)，吸光度值很小。因此，說明了其他糖類對葡萄糖的選擇性測定沒有影響。

3.6 實際樣品的測定

為了驗證基于Fe(II)葡萄糖檢測新方法的實用性，本實驗選取尿液作為實際樣品，用于檢測尿液中葡萄糖的含量。正常人的尿液650nm吸光度值很小，隨著加入糖尿病患者尿液體積的增加，吸光度越來越大。該檢測結(jié)果表明此方法適用于檢測糖尿病病人中尿液的葡萄糖含量，對于其它實際樣品也有一定的實用性，是一種能有效檢測葡萄糖含量的新方法。

4 結(jié)論

本研究利用Fe(II)催化TMB-H2O2體系建立了一種簡潔、快速的分光光度法并用于葡萄糖的檢測。該方法具有一些優(yōu)點：不需要任何化學(xué)修飾和合成，成本較低。整個檢測過程都在均相溶液中進行，非常方便。將此方法用于實際樣品尿液的測定，由檢測結(jié)果可知，該方法可行性高，結(jié)果可靠。因此，本文所構(gòu)建的分光光度法為檢測葡萄糖含量提供了一種新途徑。