朱田密 ，陳樹和，張金亮，陳科力

(1.湖北省中醫(yī)院 藥事部，湖北 武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)藥研究院 中藥研究所，湖北 武漢 430074；3.武漢華夏理工學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430223；4.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430065)

石上柏是卷柏科卷柏屬植物深綠卷柏Selaginella doederleinii Hieron.的全草，為臨床常用中藥，具有清熱，除濕，解毒的功效；主治咽喉腫痛，目赤腫痛，肺熱咳嗽，濕熱黃疸，風(fēng)濕痹痛[1]。臨床中還治療婦科等疾患。石上柏化學(xué)成分含有生物堿類和黃酮類等，其中所含有的雙黃酮類是卷柏科以及某些裸子植物的特征化學(xué)成分[2]。這類成分具有抗氧化，抗腫瘤，抗病毒，降血糖等活性[3-6]。Wang G等從深綠卷柏的乙酸乙酯部位檢測(cè)到9種具有抗氧化效果的雙黃酮[7]。而純化后的總雙黃酮的抗氧化活性尚未見報(bào)道。筆者對(duì)石上柏中的總雙黃酮進(jìn)行提取純化，并分析組成，測(cè)試抗氧化活性。DPPH是一種穩(wěn)定的氮中心的自由基，廣泛用于評(píng)價(jià)各種合成的或天然的抗氧化劑對(duì)自由基的直接清除作用[8]。本研究利用DPPH自由基清除法評(píng)價(jià)石上柏中雙黃酮類的抗氧化活性。

1 儀器與試藥

ES225SM-DR電子天平(瑞士普利賽斯公司)，4000 Q TRAP液質(zhì)聯(lián)用儀(美國AB Sciex公司)，SPECORD plus210紫外可見分光光度計(jì)(德國耶拿分析儀器股份公司)，XW-80A微型旋渦混合儀(金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司)。

石上柏中藥飲片(湖北辰美中藥有限公司，產(chǎn)地湖北)，經(jīng)筆者鑒定為石上柏即深綠卷柏Selaginella doederleinii Hieron.的干燥全草，樣品留存于湖北省中醫(yī)院中藥研究所標(biāo)本室；抗壞血酸(L-Ascorbic acid，美國Sigma公司)；DPPH自由基(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，美國Sigma公司)；聚酰胺粉(武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司)；Sephadex LH-20(北京慧德易科技有限責(zé)任公司)；無水乙醇，三氯甲烷，甲醇等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 雙黃酮的提取與成分分析

取40g石上柏中藥飲片用90%乙醇500mL回流提取5次，過濾，濃縮，干燥，得干膏。干膏經(jīng)聚酰胺柱色譜(30～60目)，40%～80%乙醇洗脫，濃縮得雙黃酮粗品；再經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠色譜，三氯甲烷-甲醇洗脫，洗脫液濃縮后得黃色粉末狀雙黃酮結(jié)晶120mg。采用HPLC-MS對(duì)樣品進(jìn)行分析，結(jié)合參考文獻(xiàn)[7]，檢測(cè)到該雙黃酮混合物由穗花杉雙黃酮(539.2[M+H]+)，羅波斯塔雙黃酮(539.2[M+H]+)，7-去甲基銀杏雙黃酮(553.2[M+H]+)，羅波斯塔-4' -甲醚(553.2[M+H]+)，羅漢松雙黃酮A(553.2[M+H]+)組成。

2.2 雙黃酮的抗氧化活性測(cè)試

取石上柏雙黃酮混合結(jié)晶5.23mg溶解于25mL無水乙醇，稀釋得6種不同濃度的樣品溶液(0.0026～0.2092mg/mL)。另配制濃度為0.05mg/mL的DPPH·無水乙醇溶液，以及6種不同濃度的抗壞血酸對(duì)照組溶液(0.0029～0.2312 mg/mL)。分別取1.0mL樣品溶液或?qū)φ杖芤号c2.0mLDPPH·溶液加入4mL塑料離心管中，渦旋混勻，避光反應(yīng)20分鐘，用紫外波長(zhǎng)516nm測(cè)量吸光度，每個(gè)樣品測(cè)三次取平均值。DPPH·清除率用下式計(jì)算[7]。I(%)=[(Ab-As)/Ab]×100%，Ab是空白樣品吸光度，As是反應(yīng)液吸光度。實(shí)驗(yàn)得到石上柏中雙黃酮與對(duì)照組抗壞血酸對(duì)DPPH·清除率的結(jié)果見圖1。由圖可知，石上柏中雙黃酮對(duì)DPPH·的清除率隨其濃度的增加而增大，實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，石上柏中雙黃酮對(duì)DPPH·的最大清除率為8.0%，而抗壞血酸為95.5%。

圖1 化合物對(duì)DPPH自由基的清除曲線

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