姜浩瀚， 呂留莊， 景志行， 汪雯翰， 許劍鋒*

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所，上海 201403）

篤斯越桔（Vaccinium uliginosumLinn.）具有可觀的觀賞價(jià)值，是珍稀的藥用植物[1]。中國(guó)越桔屬植物豐富，目前常見(jiàn)的品種均引種于國(guó)外[2]。越橘中富含花色苷、天然視紫質(zhì)等活性成分，具有預(yù)防腦神經(jīng)衰老[3]，改善心血管功能和抗癌等顯著的生物活性[4]。目前研究表明，越橘中花色苷在減輕目眩[5]；保護(hù)血管，促進(jìn)視紅細(xì)胞再生方面有特殊的功效[6]。野生越桔花青苷種類及含量豐富，其花色苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)到3.3~33.8 mg/kg，遠(yuǎn)高于人工栽培5~20倍[7-8]。隨著國(guó)家經(jīng)濟(jì)實(shí)力提升，人民生活水平逐步提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變等因素，腫瘤的發(fā)病率也在逐年上升。近年來(lái)，已有部分研究表明黃酮類合化物具有抗腫瘤及逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的活性，如芹菜素 （apigenin）[9]、 夫 拉 平 度 （flavopiridol）[10]、佩 蘭 素（eupatorin）[11]等。近幾年，國(guó)外相關(guān)研究表明花青素在抑制腫瘤增殖和阻斷致癌因子、誘導(dǎo)細(xì)胞擴(kuò)散方面發(fā)揮一定作用，但有關(guān)花青素針對(duì)肺腺癌細(xì)胞SPCA-1的抗腫瘤特性以及作用機(jī)理尚未發(fā)現(xiàn)有研究報(bào)道。

作者以人肺腺癌細(xì)胞系SPCA-1為研究對(duì)象，參照高效的總花青素提取方法[12-15]，通過(guò)檢測(cè)篤斯越桔總花青素對(duì)體外培養(yǎng)SPCA-1腫瘤細(xì)胞活力的抑制作用、細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)，深入研究其作用機(jī)理，為中國(guó)野生篤斯越桔進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和相關(guān)抗癌藥物的發(fā)現(xiàn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篤斯越桔：大興安嶺林區(qū)并在-20℃凍存；甲酸、蒸餾水、甲醇（分析純），購(gòu)自上海辛森化學(xué)科技有限公司；大孔樹(shù)脂：XAD-7，購(gòu)自鄭州勤實(shí)科技有限公司；SPCA-1細(xì)胞株，由上海海洋大學(xué)保存?zhèn)鞔籖PMI-1640、無(wú)色RPMI-1640和胎牛血清，購(gòu)自GIBCO公司；活性氧檢測(cè)試劑盒（S0033），購(gòu)自上海前塵生物科技有限公司；Ribonuclease A（RNase A）、alamarBlue@ 、Propidium iodide（PI），均購(gòu)自上海浩洋生物科技有限公司；凋亡試劑盒、P53、Caspase-3、Bcl-2、Bax試劑盒，購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BD Accuri C6流式細(xì)胞儀，美國(guó)碧迪公司產(chǎn)品；TG-17高速冷凍離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司產(chǎn)品；Christ Alpha 2-4 LD冷凍干燥機(jī)，天津鈞星瑞科技有限公司產(chǎn)品；BC-R2005型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海一科儀器有限公司產(chǎn)品；Synergy-HT多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-TEK公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 中國(guó)野生篤斯越桔中總花青素制備 按照Prior等[12-15]實(shí)驗(yàn)方法稍作修改，將篤斯越桔凍果勻漿并凍干成粉，取200 g粉末，加入2 L（甲醇∶水∶甲酸=85∶15∶0.5，體積比），超聲 5 min，4 ℃、6000 r/min離心10 min并回收上清液。 重復(fù)上述操作3次，合并清液，4℃、8000 r/min離心10 min，上清旋轉(zhuǎn)蒸干備用。

1.3.2 中國(guó)野生篤斯越桔總花青素純化 基于XAD-7的大孔樹(shù)脂柱，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇洗脫2~3個(gè)體積，用蒸餾水洗清洗后，再用2~3倍體積分?jǐn)?shù)0.5%甲酸-水溶液飽和吸附柱，加入上清液待充分吸附后，體積分?jǐn)?shù)0.5%甲酸-甲醇溶液洗脫，回收總花青素并去除甲醇，除酸后冷凍干燥成粉并置于-20℃保存。

1.3.3 SPCA-1細(xì)胞培養(yǎng)及生長(zhǎng)抑制研究 SPCA-1細(xì)胞復(fù)蘇接種于250 mL培養(yǎng)瓶中，選取DMEM培養(yǎng)基，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞培養(yǎng)皿中細(xì)胞采用胰酶消化，吹打成細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至 2×104個(gè)/mL，每孔200 μL接種于96孔板中并培養(yǎng)4~6 h。待細(xì)胞貼壁，除去舊培養(yǎng)基，分別加入質(zhì)量濃度不等的樣品（50、80、100、150 μg/mL 和 200 μg/mL） 培 養(yǎng) 基100 μL，其中 25 μg/mL 的 5-氟尿嘧啶（5-Fu）是陽(yáng)性對(duì)照，DMSO是陰性對(duì)照。置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)72 h，更換培養(yǎng)基，分別加入180 μL培養(yǎng)基和20 μL Alamar blue原液并置于培養(yǎng)箱中。測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm和600 nm時(shí)的吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算抑制率并求IC50值。

式（1）中：S，抑制率，%；A1，樣品組 570 nm 吸光度；A2，樣品組600 nm 吸光度；A3，控制組570 nm 吸光度；A4，控制組600 nm 吸光度。

1.3.4 花青素對(duì)SPCA-1細(xì)胞早期凋亡影響 調(diào)整生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SPCA-1細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，每孔1 mL細(xì)胞懸液接種于12孔板，本組實(shí)驗(yàn)包含陰性對(duì)照組 （體積分?jǐn)?shù) 5‰ DMSO），3組樣品組（50、100 μg/mL 和 200 μg/mL） 和 陽(yáng) 性 對(duì) 照 組（25 μg/mL 5-Fu），分別向 3 個(gè)樣品組加入含有 50、100 μg/mL和200 μg/mL花青素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%EDTA進(jìn)行離心，收集細(xì)胞。一部分加入2.5 μL Annexin V-FITC和2 μL PI、300 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞混勻，室溫避光孵育15 min，F(xiàn)ACS標(biāo)準(zhǔn)程序測(cè)定。另一部分加入 100 μL 含 1 μg/mL PI和 500 μg/mL Rnase A 的PBS溶液，常溫放置30 min，加300 μL PBS后，F(xiàn)ACS標(biāo)準(zhǔn)程序測(cè)定。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)PI染色法檢測(cè)對(duì)SPCA-1細(xì)胞周期影響 按照1.3.3方法培養(yǎng)SPCA-1細(xì)胞并將其分為陰性對(duì)照組，4 個(gè)樣品組 （50、80、100 μg/mL和200 μg/mL）和陽(yáng)性對(duì)照組。分別向樣品組中加入含 50、80、100 μg/mL 和 200 μg/mL 花青素培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h，離心并收集細(xì)胞，加預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，4℃固定，再次離心，細(xì)胞用PBS溶液清洗 2 次，加 500 μg/mL Rnase A 和 100 μL 含 1 μg/mL PI的PBS試液，放置30 min，加300 μL PBS后，F(xiàn)ACS標(biāo)準(zhǔn)程序測(cè)定。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)DCF染色法檢測(cè)SPCA-1細(xì)胞ROS釋放 按照1.3.3方法培養(yǎng)SPCA-1細(xì)胞并將其分為陰性對(duì)照組，4 組樣品組 （20、50、100 μg/mL和 200 μg/mL）和陽(yáng)性對(duì)照組，加入含 20、50、100 μg/mL 和 200 μg/mL 花青素培養(yǎng)基；37 ℃培養(yǎng)24 h，倒除培養(yǎng)基，加入400 μL含有50 mmol/L DCF 的 PBS，37 ℃培養(yǎng) 30 min，除上清液加 300 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%EDTA，用FACS標(biāo)準(zhǔn)程序檢測(cè)。

1.3.7 花青素對(duì) SPCA-1細(xì)胞 Caspase-3、P53、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

1）不同質(zhì)量濃度藥物處理細(xì)胞。收集細(xì)胞，1000 r/min、3 min離心，除上清液，調(diào)整培養(yǎng)基濃度為5×106個(gè)，定培養(yǎng)基至5 mL，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)4~6 h，分別每孔加入樣品使質(zhì)量濃度為 5-Fu（12.5、50 μg/mL）、花青素（50、80、100、200 μg/mL）的培養(yǎng)基 5 mL，DMSO 溶液為陰性對(duì)照，37℃培養(yǎng)48 h。

2）準(zhǔn)備細(xì)胞提取物。細(xì)胞在4℃、1000 r/min條件下，離心10 min并收集，用PBS洗細(xì)胞一次；預(yù)冷的Cell Lysis Buffer溶液稀釋細(xì)胞到目標(biāo)濃度。在冰上孵育5 min。4℃、10 min離心；取上清液，保存至-70℃。

3）Caspase-3、 P53、Bcl-2、Bax 活 性 測(cè) 試 。Caspase-3、P53、BAX、Bcl-2 蛋白活性的測(cè)定方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用軟件FlowJo7.6.3分析，并對(duì)各項(xiàng)結(jié)果使用spss 20進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國(guó)野生篤斯越桔花青素對(duì)SPCA-1細(xì)胞增殖的影響

由圖1可知，SPCA-1細(xì)胞增殖作用明顯受到野生篤斯越桔總花青素的抑制，且呈顯著的依賴性，數(shù)據(jù)分析顯示野生篤斯越桔花青素對(duì)SPCA-1細(xì)胞增殖抑制作用的IC50值為107.399 μg/mL。

圖1 不同質(zhì)量濃度總花青素對(duì)SPCA-1細(xì)胞增殖抑制作用Fig.1 Inhibition effect of different concentrations of anthocyanins on SPCA-1 cells proliferation

2.2 中國(guó)野生篤斯越桔花青素對(duì)SPCA-1細(xì)胞早期凋亡的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，當(dāng)50、100 μg/mL和200 μg/mL花青素組早期細(xì)胞凋亡率分別為20.3%，28.3%和39.5%，均明顯高于陰性對(duì)照組，且呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性。由表1可得出，較之陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組、100 μg/mL 和 200 μg/mL 樣品組均呈現(xiàn)極顯著性差異。

2.3 中國(guó)野生篤斯越桔花青素對(duì)SPCA-1細(xì)胞周期的影響

花青素處理組都能明顯降低處于G0/G1期細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而能引起 SPCA-1細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)表明凋亡細(xì)胞主要來(lái)自于 G0/G1期細(xì)胞，如圖3所示；參照陽(yáng)性對(duì)照，雖然也引起凋亡細(xì)胞比率的上升，但是凋亡細(xì)胞主要來(lái)自于G2/M期，兩者的處在不同作用時(shí)期。

圖2 不同質(zhì)量濃度花青素對(duì)SPCA-1細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of different concentrations of anthocyanins on apoptosis of SPCA-1 cell

表1 不同質(zhì)量濃度花青素誘導(dǎo)SPCA-1細(xì)胞凋亡率（x±s）Table 1 Rate of SPCA-1 cell apoptosis induce by different concentrations of anthocyanins

圖3 不同質(zhì)量濃度花青素對(duì)SPCA-1細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effect of different concentrations of anthocyanins on SPCA-1 cell cycle

2.4 中國(guó)野生篤斯越桔花青素對(duì)SPCA-1細(xì)胞ROS釋放的影響

結(jié)果如圖4所示，在20 μg/mL的質(zhì)量濃度時(shí)ROS 釋放不明顯， 在 50、100 μg/mL 和 200 μg/mL的花青素均能明顯引起ROS的釋放，尚未發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性。 因?yàn)橐延醒芯勘砻髂[瘤細(xì)胞凋亡，F(xiàn)as-FasL受體途徑和線粒體途徑在很大程度上都依賴于ROS，而且2種途徑是相互聯(lián)系的，與ROS水平密切相關(guān)。

圖4 不同質(zhì)量濃度花青素對(duì)SPCA-1細(xì)胞ROS釋放的影響Fig.4 Effect of different concentrations of anthocyanins on ROS release of SPCA-1 cells

2.5 總花青素對(duì)SPCA-1細(xì)胞Caspase-3、P53、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

由表2可知，經(jīng)不同質(zhì)量濃度花青素處理48 h后的SPCA-1細(xì)胞內(nèi)Caspase-3質(zhì)量濃度均比陰性對(duì)照組增強(qiáng)。較之于陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組以及樣品質(zhì)量濃度為 100 μg/mL 和 200 μg/mL 時(shí)Caspase-3 表達(dá)差異極顯著（P＜0.01）。

表2 不同質(zhì)量濃度花青素對(duì)Caspase-3蛋白表達(dá)的影響Table 2 Effect of different concentrations of anthocyanins on Caspase-3 protein expression of SPCA-1 cells

由表3可知，經(jīng)不同質(zhì)量濃度花青素處理48 h后的SPCA-1細(xì)胞內(nèi)P53質(zhì)量濃度均比陰性對(duì)照組增強(qiáng)，較之陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組12.5 μg/mL以及花青素質(zhì)量濃度為50、80 μg/mL時(shí)沒(méi)有表現(xiàn)出顯著性差異，但在陽(yáng)性對(duì)照組50 μg/mL、樣品質(zhì)量濃度為100 μg/mL和200 μg/mL時(shí)存在極顯著差異（P＜0.01）。

表3 不同質(zhì)量濃度花青素對(duì)SPCA-1細(xì)胞P53蛋白表達(dá)的影響Table 3 Effect of different concentrations of anthocyanins on P53 protein expression of SPCA-1 cells

由表4和表5可知，經(jīng)不同質(zhì)量濃度花青素處理48 h后的SPCA-1細(xì)胞內(nèi)BAX蛋白質(zhì)量濃度含量均比陰性對(duì)照組增強(qiáng)。較之陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組50 μg/mL以及花青素質(zhì)量濃度為100 μg/mL和 200 μg/mL 時(shí)均具有極顯著性差異（P＜0.01）。 與之對(duì)應(yīng)的Bcl-2蛋白質(zhì)量濃度陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組對(duì)比陰性對(duì)照組均表現(xiàn)為下降，同樣地，與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組50 μgmL/及花青素質(zhì)量濃度為100 μg/mL和200 μg/mL時(shí)均具有極顯著性差異（P＜0.01）。

表4 不同質(zhì)量濃度花青素對(duì)SPCA-1細(xì)胞BAX蛋白表達(dá)的影響Table 4 Effect of different concentrations of anthocyanins on BAX protein expression of SPCA-1 cells

表5 不同質(zhì)量濃度花青素對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Table 5 Effect of different concentrations of anthocyanins on Bcl-2 protein expression of SPCA-1 cells

3 結(jié)語(yǔ)

肺癌發(fā)病率在國(guó)內(nèi)外仍處于不斷上升態(tài)勢(shì)，據(jù)統(tǒng)計(jì)報(bào)道，肺癌一直居于各種腫瘤發(fā)病的榜首，關(guān)于肺癌研究和治療技術(shù)動(dòng)態(tài)因此備受矚目。據(jù)病理學(xué)上分類可以將肺癌細(xì)分為鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌、腺鱗癌等，實(shí)驗(yàn)選取的SPCA-1肺腺癌細(xì)胞屬于人肺腺癌系，人肺腺癌在亞州地區(qū)較為常見(jiàn)，也是與吸煙相關(guān)的組織類型[16]。本實(shí)驗(yàn)研究表明中國(guó)野生篤斯越桔花青素對(duì)體外SPCA-1細(xì)胞活力及增殖有明顯的抑制作用，同時(shí)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其改變細(xì)胞周期，細(xì)胞周期阻斷在S期，并且有早期凋亡現(xiàn)象的產(chǎn)生。

研究表明，花青素通過(guò)作用于周期調(diào)控蛋白（P53、BAX、Bcl-2）、 細(xì)胞周期蛋白 D1 和細(xì)胞周期蛋白A等來(lái)阻滯細(xì)胞周期的各個(gè)階段，從而發(fā)揮抗增殖作用[17]，因而提示花青素導(dǎo)致SPCA-1細(xì)胞G2/M期比例下降的作用，可能是通過(guò)作用于以上調(diào)控蛋白來(lái)完成的。生物體內(nèi)存在著一套完善的氧化—抗氧化平衡體系，當(dāng)平衡打破，ROS持續(xù)升高時(shí)，將促使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化、進(jìn)而引起細(xì)胞的凋亡。本文研究發(fā)現(xiàn)花青素能引起肺癌細(xì)胞SPCA-1細(xì)胞ROS釋放量增加，表明青花素的促細(xì)胞凋亡作用可能通過(guò)引起ROS釋放來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

Bcl-2家族包括Bax、Bak等促調(diào)亡蛋白，Bcl-2、Bd-xL等抑調(diào)亡蛋白，大多數(shù)由C端跨膜結(jié)構(gòu)域和Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。研究認(rèn)為Bcl-2蛋白是可以防止ROS對(duì)細(xì)胞的損傷，而ROS升高會(huì)上調(diào)Bax蛋白的表迗，從而誘導(dǎo)細(xì)胞色素 C的釋放，啟動(dòng)調(diào)亡[18]。Caspase乃調(diào)亡中最重要的酶，ROS通過(guò)與它的相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡。研究表明ROS的產(chǎn)生需要Caspase的激活，Caspase—旦被抑制，ROS的增加也被阻斷[19]。本文研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)野生篤斯越桔花青素在濃度為50~200μg/mL范圍內(nèi)均能使 SPCA-1細(xì)胞 Caspase-3、P53、BAX蛋白的表達(dá)量有不同程度增加，而B(niǎo)cl-2的表達(dá)量則一定程度下降。

在功能食品開(kāi)發(fā)方面，植物的來(lái)源以及活性成分的種類含量一直都是重要的考量標(biāo)準(zhǔn)。除了花青素含量上存在優(yōu)勢(shì)以外，實(shí)驗(yàn)表明野生篤斯越桔有近13種花色苷單體遠(yuǎn)高于其他漿果[20]。中國(guó)有大面積的野生篤斯越桔得不到充分利用，結(jié)合特殊的生物活性，加工成相應(yīng)的功能食品則具有寬廣的應(yīng)用前景。伴隨著花色苷抗腫瘤作用的深入研究以及各類花青素單體之間協(xié)同作用機(jī)制的進(jìn)一步清晰，花青素有成為抗腫瘤生物醫(yī)藥的潛力，還兼具了發(fā)揮其對(duì)人體有利的其他功能特性優(yōu)勢(shì)。