田慧慧， 吳 婧， 伍亞玲， 徐 政， 陳荊曉， 陳敬華

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

隨著人類基因組計(jì)劃的開展，基因與多種重大疾病之間的關(guān)系受到人們的關(guān)注?；虔煼ㄗ鳛橐环N將外源性基因?qū)氚屑?xì)胞，用于治療因基因缺陷或異常所引起疾病的方法，對(duì)治療癌癥、心血管疾病、遺傳病等多種重大疾病具有較高的潛力[1-2]。大量研究表明，載體是影響基因治療效果的關(guān)鍵因素之一。利用安全、穩(wěn)定的載體不僅能有效保護(hù)目的基因不被體內(nèi)的酶降解[3]，還有助于提高基因的傳遞和轉(zhuǎn)染效率。

目前，臨床研究中更傾向于使用以聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）為代表的非病毒載體。這主要是因?yàn)榉遣《据d體不僅易制造、易修飾、價(jià)格低廉，還能夠避免病毒載體誘發(fā)的生物安全性方面的缺陷[4-5]。病毒載體可能在染色體上隨機(jī)插入激活原癌基因，誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)而造成其他病癥[6]。PEI這種陽離子高分子材料，可以有效壓縮DNA并將其傳遞至細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而通過“質(zhì)子海綿”效應(yīng)釋放目的基因進(jìn)入細(xì)胞核，實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染[7]。不過，PEI高正電荷密度的性質(zhì)也導(dǎo)致其容易破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而表現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒性。PEI還易與帶負(fù)電荷的血漿蛋白結(jié)合，在血液循環(huán)過程中被機(jī)體清除[8]。此外，PEI缺乏對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力，在治療過程中不具有選擇性。為解決上述問題，研究人員嘗試用可斷裂的化學(xué)鍵交聯(lián)低相對(duì)分子質(zhì)量PEI，或?qū)ζ浔砻孢M(jìn)行修飾，以降低其電荷密度，提高靶向性[9]。另一策略是利用電荷相互作用，將PEI與負(fù)電性材料結(jié)合，得到納米聚電解質(zhì)復(fù)合物作為載體[10-11]。有報(bào)道用帶弱負(fù)電的透明質(zhì)酸 （hyaluronic acid，HA）與PEI制備聚電解質(zhì)復(fù)合物，不僅能夠避免與血漿蛋白吸附，還可以利用HA與腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)的CD44受體之間的識(shí)別作用，提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性[12]。除此之外，HA作為一種天然多糖還具有生物相容性好、可生物降解的優(yōu)點(diǎn)[13]。然而，聚電解質(zhì)復(fù)合物依賴于聚陽離子和聚陰離子化合物之間的電荷相互作用[14]，這會(huì)造成聚陰離子與DNA之間競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致DNA包裹不夠緊密而泄漏，降低轉(zhuǎn)染效率。因此，如何提高載體穩(wěn)定性，防止DNA泄漏失活，是這類材料實(shí)現(xiàn)高效基因傳遞的關(guān)鍵。

組氨酸（Histidine，His）是一種廣泛用于 pH敏感性材料制備的氨基酸。由于His分子結(jié)構(gòu)中含有咪唑基團(tuán)（pKa～6.0），其在生理pH 7.4條件下表現(xiàn)為疏水性，在pH＜6時(shí)又吸收質(zhì)子表現(xiàn)出親水性[15]。利用His的這一特性，本研究中用His分別修飾PEI和 HA，制備 PEI-His（PH）和 HA-His（HH），之后通過正負(fù)電荷吸附，兩步包載得到HH/PH/DNA（HPD）復(fù)合物。PEI經(jīng)His修飾能降低表面電荷密度，從而降低其細(xì)胞毒性；同時(shí)保持對(duì)DNA的包裹能力。HA經(jīng)His修飾，可減少其與DNA間對(duì)電荷的競(jìng)爭(zhēng)，利用His在生理pH下的疏水性，還能使復(fù)合物結(jié)構(gòu)更加緊密。另外，利用HA對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別作用，還可以提高材料傳遞基因時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

HA（Mw：6.2×103），山東福瑞達(dá)生物化工有限公司產(chǎn)品；透明質(zhì)酸酶 （HAase）、脫氧核糖核酸酶I（DNase I），上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品；L-組氨酸（L-His）、1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）、枝化 PEI（Mw：25 kDa）、噻唑藍(lán)（MTT）、胰酶、上海阿拉丁試劑有限公司產(chǎn)品；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS），美國Gibco Invitrogen公司產(chǎn)品；pEGFP-N1 pDNA，美國Promega公司產(chǎn)品。

1.2 儀器

FreeZone 2.5 L型冷凍干燥機(jī)，美國Labconco公司產(chǎn)品；Avance III型核磁共振波譜儀（400 MHz），德國Bruker公司產(chǎn)品；JEM-2100型透射電子顯微鏡，日本JEOL公司產(chǎn)品；Zetasizer Nano ZS型激光粒度儀，英國Malvern公司產(chǎn)品；Multiskan GO型酶標(biāo)儀，美國Thermo公司產(chǎn)品；DMIL/LED型熒光顯微鏡，德國Leica公司產(chǎn)品；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀，美國BD公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞株

小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16）和非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞（COS7），購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞保藏中心。

1.4PH和HH的制備

將200 mg和400 mg的His分別溶解于50 mL去離子水中，加入0.93 g EDC·HCl和0.70 g NHS，調(diào)節(jié)溶液pH至4～5，于室溫?cái)嚢? h，之后分別加入8 mL的PEI溶液（25 mg/mL），調(diào)節(jié)pH至 7.4，繼續(xù)反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后將溶液裝入透析袋，對(duì)去離子水透析除去未反應(yīng)的His及雜質(zhì)，凍干得PH1和PH2，用1H NMR驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。

將100 mg的HA溶于50 mL去離子水中，加入 72.8 mg EDC·HCl和 43.7 mg NHS，反應(yīng) 1 h 后，向溶液中加入78.5 mg His。室溫?cái)嚢?4 h后，將溶液裝入透析袋，對(duì)去離子水透析除去未反應(yīng)的His及雜質(zhì)，凍干得HH，用1H NMR驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。

1.5 PD和HPD復(fù)合物的制備

將 1 mL pDNA 溶液（100 μg/mL）加入到 1 mL不同質(zhì)量濃度的 PH1 和 PH2 溶液（20、50、100、200、500 μg/mL）中，渦旋振蕩，室溫靜置 30 min，得到具有不同 PH/DNA 質(zhì)量比（分別為 1∶5，1∶2，1∶1，2∶1，5∶1）的復(fù)合物，分別標(biāo)記為 PD1 和 PD2。

將 1 mL pDNA 溶液（100 μg/mL）滴加到 1 mL PH1 溶液（200 μg/mL）中，渦旋振蕩，室溫靜置 30 min，之后將所得PD復(fù)合物溶液滴加到不同質(zhì)量濃度的 2 mL HH 溶液（150、200、250、300、350 μg/mL）中，渦旋振蕩，室溫靜置30 min，得到具有不同HH/PH1/DNA 質(zhì)量比（分別為 3∶2∶1，4∶2∶1，5∶2∶1，6∶2∶1，7∶2∶1）的 HPD 復(fù)合物。

1.6 PD和HPD的表征

取18 μL上述制備的PD和HPD復(fù)合物，加入2 μL Loading Buffer（10×），通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)復(fù)合物對(duì)DNA的包載能力，用凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果；取1 mL上述制備的PD和HPD復(fù)合物用粒徑儀測(cè)定復(fù)合物的平均粒徑及ζ-電位，通過TEM觀測(cè)HPD復(fù)合物的微觀形貌。

1.7 復(fù)合物酶穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

參照1.5中方法制備HPD復(fù)合物，取15 μL溶液，在不同樣品中分別加入 1 μL HAase（3 U/μL）和1 μL DNase I（10 U/μL），另取 3 μL 裸 pDNA 溶液直接加入 1 μL DNase I（10 U/μL），樣品于 37 ℃孵育30 min，再于65℃加熱20 min終止反應(yīng)，所有樣品用超純水補(bǔ)齊體積至 18 μL，加 2 μL Loading Buffer（10×），之后進(jìn)行瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)，用凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

材料的細(xì)胞毒性用B16和COS7細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試。將細(xì)胞分別以8000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，B16細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，COS7細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。之后小心移去培養(yǎng)基，加入 100 μL 含不同質(zhì) 量濃度 （1、10、20、50、100、200、300、500 μg/mL）PEI、PH 和 HH 的培養(yǎng)基溶液，其中PEI溶液質(zhì)量濃度與PH1、PH2溶液中對(duì)應(yīng)的PEI質(zhì)量濃度一致，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL MTT溶液，37℃下繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后吸除MTT，每孔再加入 100 μL DMSO混合均勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在570 nm下的光密度值（OD570），計(jì)算細(xì)胞存活率，如下式（1）。

以不加樣品作為空白對(duì)照，每組3個(gè)平行樣。

1.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

以pEGFP-N1 pDNA為報(bào)告基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。首先將細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種到6孔板中，吸出培養(yǎng)基后，加入1 mL含復(fù)合物的培養(yǎng)基溶液，其中pDNA的質(zhì)量為4 μg，于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸出含藥培養(yǎng)基，加入1 mL含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的新鮮培養(yǎng)基，于37℃的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)20 h，用無菌PBS緩慢沖洗3次，用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。細(xì)胞用胰酶消化，用PBS制成細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況進(jìn)行定量檢測(cè)，以空白細(xì)胞作為陰性對(duì)照，以PEI/DNA（N/P=10）復(fù)合物為陽性對(duì)照，每組3個(gè)平行樣。其中，PD 復(fù)合物的質(zhì)量比分別為 1∶2、1∶1、2∶1，HPD 復(fù)合物的質(zhì)量比為 7∶2∶1。

2 結(jié)果與討論

2.1PH以及HH的1H NMR譜圖分析

PH和HH分別用1H NMR表征其化學(xué)結(jié)構(gòu)。見圖 1（a），在 2.9~3.20（m，4H，-CH2CH2-）處為 PEI分子中亞甲基的氫，7.25（s，1H，-N=CH-）為 His咪唑環(huán)上的 H-2，8.02（s，1H，-N=CH-）為 His咪唑環(huán)上的H-1，表明His已成功連接到PEI分子。通過峰面積計(jì)算His在PH1中取代度為3.2%，在PH2中取代度為 7.3%。 見 1（b），1.98（s，3H，CH3-CO-）處為HA 上 N-乙酰甲基的氫，7.22（s，H，-N=CH-）為 His咪唑環(huán)上的 H-b，8.49（s，1H，-N=CH-）為 His咪唑環(huán)上的H-a，表明His已成功連接至HA分子，通過峰面積比計(jì)算得到His在HH上的取代度為6.2%。

圖1 PH1、PH2與HH的化學(xué)結(jié)構(gòu)及核磁共振譜圖Fig.1 Chemical structures and1H NMR spectra of PH1，PH2 and HH

2.2 PD的瓊脂糖凝膠電泳

材料對(duì)DNA的有效包載是實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的首要條件，因此先通過瓊脂糖凝膠電泳測(cè)試2種PH對(duì)DNA的包載能力。從圖2中可以看出，當(dāng)PEI/pDNA的質(zhì)量比為1∶5時(shí)，PEI即可完全包載pDNA，而當(dāng)PD1的質(zhì)量比大于 1∶5，PD2的質(zhì)量比大于 1∶2時(shí)，可在孔中觀察到pDNA條帶，說明此時(shí)載體可包載pDNA并形成復(fù)合物，pDNA不會(huì)隨電場(chǎng)在凝膠中移動(dòng)。與PEI相比，PH包裹DNA的能力有所減弱，這是因?yàn)榻?jīng)His修飾，PH1和PH2與PEI相比，其表面的正電荷密度有所降低所致，但其對(duì)DNA的復(fù)合能力得以保持。由于His在PH1上的取代度（3.2%）低于在PH2上的取代度（7.3%），因而PH1攜帶更多的正電荷，其對(duì)DNA的包載能力更強(qiáng)。

圖2 PEI/pDNA、PD1與PD2復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳阻滯圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PEI/pDNA，PH1/pDNA and PH2/pDNA complexes

2.3 PD的平均粒徑和電位

PD復(fù)合物的平均粒徑和ζ-電位如圖3所示。2種PH都可以有效壓縮pDNA形成納米尺度的復(fù)合物。隨著質(zhì)量比逐漸增加至5∶1，PD1和PD2復(fù)合物的平均粒徑分別減小至103 nm和112 nm，而ζ-電位則逐漸增加至53 mV和40 mV。對(duì)于2種PD而言，當(dāng)質(zhì)量比大于1∶2時(shí)，載體表面攜帶正電荷，這表明PH已經(jīng)完全包載pDNA，該結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)結(jié)果一致。同質(zhì)量比條件下，由于PH1比PH2的正電荷密度更高，因此PD1的ζ-電位更高，其在溶液中穩(wěn)定性也更好。根據(jù)粒徑和ζ-電位的值，選用質(zhì)量比為 1∶2、1∶1 和 2∶1 進(jìn)行 2 種復(fù)合物的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，以找出其最佳轉(zhuǎn)染條件。

圖3 PD1、PD2復(fù)合物的平均粒徑及ζ-電位Fig.3 Average size and ζ-potential of PD1 and PD2 complexes

2.4 PD復(fù)合物轉(zhuǎn)染性能評(píng)價(jià)

PD復(fù)合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示?？梢钥闯?，在PD1和PD2的質(zhì)量比為2∶1時(shí)，PH1能夠更為有效地介導(dǎo)pDNA實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染，效率明顯高于PH2。由于復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染依賴于其粒子大小，以及粒子表面正電荷與細(xì)胞膜表面負(fù)電荷之間的相互作用。PD1較PD2而言，其ζ-電位更高，而其平均粒徑更小，因而更利于其傳遞更多的pDNA進(jìn)入細(xì)胞。當(dāng)2種PD的質(zhì)量比為1∶1和1∶2時(shí)，轉(zhuǎn)染效率偏低，這可能是因?yàn)槠浔砻骐姾擅芏认陆担覐?fù)合物粒徑偏高導(dǎo)致其進(jìn)入細(xì)胞的效率降低所致。因而選用PH1/pDNA的質(zhì)量比為2∶1進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖4 pDNA/PEI、PD1和PD2復(fù)合物對(duì)B16細(xì)胞誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染的流式分析圖Fig.4 Flow cytometric analysis of pDNA/PEI，PH1/pDNA and PH2/pDNA induced gene transfection with B16 cells

2.5HPD的DNA包載能力

從HPD復(fù)合物平均粒徑及ζ-電位圖 （圖5）中可以看出，隨著質(zhì)量比的變化，復(fù)合物的粒徑趨于穩(wěn)定。質(zhì)量比為4∶2∶1時(shí)，復(fù)合物表面ζ-電位接近于0 mV，復(fù)合物之間受到的表面電荷的排斥力減小，產(chǎn)生團(tuán)聚，導(dǎo)致粒徑增大。當(dāng)質(zhì)量比調(diào)節(jié)至5∶2∶1時(shí)，復(fù)合物的粒徑減小至183 nm，ζ-電位減小至-8 mV。當(dāng)質(zhì)量比變?yōu)?7∶2∶1時(shí)，HPD 復(fù)合物粒徑為109 nm，這一尺寸適合復(fù)合物粒子進(jìn)入細(xì)胞，而其ζ-電位逐漸降低達(dá)到-15 mV，表明PD1已經(jīng)完全被HH包裹。HPD粒子表面呈負(fù)電荷，可以減少與血清蛋白吸附，增加材料在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。后續(xù)選用HPD質(zhì)量比為7∶2∶1進(jìn)一步測(cè)試。

圖5 HPD復(fù)合物的平均粒徑及ζ-電位Fig.5 Average size and ζ-potential of HH/PH1/pDNA complexes

HPD復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6。結(jié)果顯示，HPD復(fù)合物在每個(gè)膠孔中均能觀察到明亮的DNA條帶，與裸DNA相比，復(fù)合物沒有產(chǎn)生與其同一位置的條帶，說明DNA并未隨HH/PH/pDNA質(zhì)量比的變化而從復(fù)合物內(nèi)部泄漏。這也說明HH的加入并未影響內(nèi)部PD復(fù)合物的穩(wěn)定性。這是因?yàn)楸狙芯吭O(shè)計(jì)中引入的His分子在pH 7.4環(huán)境下表現(xiàn)出疏水性，這使得HH表現(xiàn)出兩親性，當(dāng)其包裹于PD表面時(shí)，His會(huì)因?yàn)槭杷饔枚M(jìn)一步向內(nèi)壓縮PD，不僅能有效避免因電荷競(jìng)爭(zhēng)而導(dǎo)致DNA泄漏，還能保持復(fù)合物的粒徑大小不受影響。

圖6 HPD復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)譜圖Fig.6 Agarose gel electrophoresis of HPD complexes

2.6 HPD的形貌和血清穩(wěn)定性

采用透射電鏡觀測(cè)HPD復(fù)合物的形貌 （圖7（a））。從圖中可以看出，復(fù)合物為規(guī)整球形，尺寸均一且分布均勻，其在干態(tài)下的平均粒徑約為60 nm。采用DLS測(cè)得復(fù)合物在水相中的平均粒徑 （圖7（b））為109 nm。這與HPD表面親水性的HH在水介質(zhì)中處于水合伸展?fàn)顟B(tài)有關(guān)。通過加入體積分?jǐn)?shù)為10%FBS驗(yàn)證HPD在含血清溶液中的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖7（c）所示，100 nm以下為血清中的固有粒子峰，這說明HPD的粒徑分布并未因加入FBS而發(fā)生變化。這是由于HPD復(fù)合物表面帶負(fù)電，可拮抗同樣帶有負(fù)電的血清。因而HPD復(fù)合物具有良好的血清穩(wěn)定性，不會(huì)與血清蛋白吸附團(tuán)聚而被代謝清除。

圖7 HPD復(fù)合物的透射電鏡圖，溶液中有或無體積分?jǐn)?shù)為10%血清時(shí)HPD復(fù)合物粒徑分布Fig.7 TEM image of HPD complexes；size distribution of HPD complexes with and without 10%serum

2.7 HPD的酶穩(wěn)定性

HPD復(fù)合物在不同條件下對(duì)pDNA的保護(hù)能力通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測(cè)試。如圖8所示，與裸DNA相比，加入DNA酶后，質(zhì)粒被降解產(chǎn)生多條條帶。HPD復(fù)合物經(jīng)DNase I處理后，DNA依然處于膠孔中，且未發(fā)現(xiàn)被降解的DNA條帶，這說明HPD不僅能負(fù)載DNA，還可有效保護(hù)DNA免于被DNA酶降解。而在與HAase作用后，DNA亦保留于膠孔當(dāng)中，并未在泳道中出現(xiàn)條帶，這說明即使HPD復(fù)合物表面的HA被酶降解，PD復(fù)合物仍然可保持穩(wěn)定，并包載DNA。綜上，HPD復(fù)合物的多層結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可有效包載并且保護(hù)DNA。

2.8 細(xì)胞毒性

圖8 不同條件下的HPD復(fù)合物穩(wěn)定性Fig.8 Agarose gel electrophoresis of HPD complexes treated with various enzymes

通過細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)對(duì)材料的細(xì)胞相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖9所示。在圖9（a）中，對(duì)于B16細(xì)胞，在質(zhì)量濃度低于20 μg/mL時(shí)，PEI與PH1的細(xì)胞毒性相差不大，而在質(zhì)量濃度高于50 μg/mL時(shí)，PH1組的細(xì)胞存活率則明顯更高，即使質(zhì)量濃度達(dá)到500 μg/mL，PH1組細(xì)胞存活率仍可達(dá)到46%。而對(duì)于COS7細(xì)胞，PEI與PH1的細(xì)胞毒性在低質(zhì)量濃度條件下即表現(xiàn)出明顯差異，在200 μg/mL時(shí)，PH1組細(xì)胞存活率仍可達(dá)到40%以上，而這一質(zhì)量濃度已經(jīng)遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)所使用的材料質(zhì)量濃度。PEI的細(xì)胞毒性主要因?yàn)楦哒姾擅芏葧?huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，致使細(xì)胞破裂而產(chǎn)生。當(dāng)PEI經(jīng)His修飾后，表面部分正電荷被屏蔽，從而降低了細(xì)胞毒性。圖9（b）中可以看出，HH對(duì)B16細(xì)胞及COS7細(xì)胞基本無毒。當(dāng)HA質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)，B16和COS7細(xì)胞的存活率依然可達(dá)到96%和103%。因此，PH和HH都具有較好的細(xì)胞相容性。

圖9 PEI、PH1和HH對(duì)B16細(xì)胞、COS7細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性Fig.9 In vitro cytotoxicity of PEI and PH1；HH against B16 and COS7 cells

2.9 HPD轉(zhuǎn)染性能

以pEGFP-N1為報(bào)告基因測(cè)定HPD復(fù)合物的轉(zhuǎn)染能力，轉(zhuǎn)染后的熒光圖以及流式細(xì)胞分析結(jié)果如圖 10 所示。圖 10（a）（I、III）中，PEI在 B16 細(xì)胞以及COS7細(xì)胞中介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率基本相同。從圖10（a）（II、IV）中可以看出，在 B16 腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)了明顯的綠色熒光，這說明HPD復(fù)合物已經(jīng)成功介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染，表達(dá)出綠色熒光蛋白。與COS7正常細(xì)胞相比，B16腫瘤細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生的綠色熒光強(qiáng)度明顯更高。此外，B16細(xì)胞中HPD介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染與PEI/pDNA介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染相比稍弱，COS7細(xì)胞中HPD介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染與PEI介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染則具有明顯差距。該結(jié)果與圖10（b）流式細(xì)胞儀結(jié)果一致，PEI在2種細(xì)胞中介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度基本相當(dāng)，而HPD介導(dǎo)的在B16細(xì)胞中表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度明顯高于COS7細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，可達(dá)到COS7細(xì)胞中熒光強(qiáng)度的2倍。這是由于B16細(xì)胞表面過度表達(dá)的CD44受體可以與HPD復(fù)合物表面的HH特異性識(shí)別，能夠增加了腫瘤細(xì)胞對(duì)HPD復(fù)合物的攝取，從而提高轉(zhuǎn)染效率。因此，HPD復(fù)合物對(duì)于腫瘤細(xì)胞的基因傳遞具有一定的選擇性。

圖10 PEI和HPD復(fù)合物對(duì)B16細(xì)胞、COS7細(xì)胞轉(zhuǎn)染的熒光圖和流式分析圖Fig.10 Fluorescent images and flow cytometric analysis of gene transfection in B16 and COS7 cells

3 結(jié)語

通過His修飾獲得了2種具有不同His取代度的PH以及一種HH。其中，His取代度為3.2%的PH1能夠更為有效地包載DNA，形成尺度在103 mm的復(fù)合物，并介導(dǎo)高效的基因轉(zhuǎn)染。之后通過二次復(fù)合，得到了HPD復(fù)合物，其在水溶液中尺寸均一，平均粒徑為109 nm，ζ-電位為-15 mV，并且能夠有效拮抗血清黏附，在DNase I和HAase存在條件下保持穩(wěn)定，保護(hù)所包載的DNA不被酶降解。利用表面的HH與CD44受體的作用，HPD復(fù)合物可以對(duì)于腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)高效的基因轉(zhuǎn)染，對(duì)B16腫瘤細(xì)胞為COS7正常細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率的2倍，體現(xiàn)出明顯的選擇性，并且材料經(jīng)His修飾后，細(xì)胞毒性明顯降低。綜上所述，HPD復(fù)合物在基因轉(zhuǎn)染研究具有較好的應(yīng)用前景。