袁 丹 常能彬 梁玉蘭 李 茂

（1.四川省瀘州市人民醫(yī)院，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000）

新生兒缺氧缺血性腦病是威脅新生兒生命健康的主要疾病之一，可造成新生兒永久性神經(jīng)功能障礙，目前臨床以對(duì)癥支持治療為主，尚無特效療法。谷紅注射液是一種復(fù)方制劑，由乙酰谷酰胺和紅花提取液制成，具有抗氧自由基、活血化瘀、改善微循環(huán)等多種功效［1］。氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量自由基和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物損傷腦細(xì)胞，在腦損傷的作用機(jī)制中發(fā)揮重要作用［2］。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）/核因子E2相關(guān)因子2（nuclear Nrf2）/血紅素加氧酶1（HO-1）通路是抗氧化防御系統(tǒng)中的重要信號(hào)通路，可通過清除自由基等降低氧化應(yīng)激反應(yīng)［3］。本研究觀察谷紅注射液對(duì)缺氧缺血新生大鼠腦損傷的保護(hù)作用并探討其分子機(jī)制，為缺血性腦疾病的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 126只健康7 d齡SD新生大鼠，體質(zhì)量8～15 g，購自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（川）2017-0003。在光照和黑暗環(huán)境交替、相同溫度和濕度條件下，由母鼠自由喂養(yǎng)。

1.2 試藥與儀器 谷紅注射液，通化谷紅制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H22026637，批號(hào)20150925；ERK抑制劑SCH772984，純度98.06%，MCE中國；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSPPx）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；ERK和p-EERK抗體，美國Santa Cruz公司；Nrf2和HO-1抗體，英國Abcam公司，貨號(hào)ab128075；β-actin和FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG，北京中杉金橋科技有限公司；ELx800-MV型酶聯(lián)免疫檢測儀，美國Bio-Tek公司；XS205型電子天平，瑞士梅特勒-托利多科學(xué)儀器；Chemi Doc TM XRS+型凝膠成像儀及電泳儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 造模與分組 從126只新生大鼠中隨機(jī)選取18只作為假手術(shù)組，其余新生大鼠參照文獻(xiàn)方法建立缺氧缺血模型［4］。腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg），麻醉后仰臥位固定于手術(shù)板上，75%酒精消毒，頸部正中切口，結(jié)扎鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合切口。術(shù)后恢復(fù)2 h，將新生大鼠置于缺氧箱中，通入8%O2和92%N2的混合氣體，氣流量2.0 L/min，缺氧2 h。假手術(shù)組大鼠除不結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈之外，其他處理相同。缺氧缺血新生大鼠隨機(jī)分為模型組，谷紅低、中、高劑量組，ERK抑制劑LY3214996組（ERK組）和ERK+谷紅組。

1.4 給藥方法 造模結(jié)束4 h后給藥。谷紅低、中、高劑量組分別按劑量2.5、5、10 mL/kg腹腔注射谷紅注射液［5］；ERK 組按劑量 10 μL/kg腹腔注射 LY3214996（5 nmol/L）［6］；ERK+谷紅組同時(shí)腹腔注射LY3214996和10 mL/kg谷紅注射液；假手術(shù)組和模型組腹腔注射等量（10 mL/kg）生理鹽水。每12小時(shí)給藥1次，共給藥5次。

1.5 大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分 給藥結(jié)束后，從每組中隨機(jī)選取6只，參照文獻(xiàn)方法對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能缺陷進(jìn)行評(píng)分［7］。神經(jīng)功能無缺陷記為0分；左側(cè)前肢伸展不完全，為輕度神經(jīng)功能缺損，記為1分；新生大鼠在行走過程中轉(zhuǎn)圈，為中度神經(jīng)功能缺損，記為2分；新生大鼠在行走過程中傾倒，為重度神經(jīng)功能缺損，記為3分；新生大鼠意識(shí)不清，不能自發(fā)行走，記為4分。神經(jīng)功能缺損評(píng)分越高，說明新生大鼠損傷越嚴(yán)重。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 1）大鼠腦組織HE染色：各組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分后，腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg），麻醉后打開胸腔，生理鹽水灌注心臟，去除血液，后改用4%多聚甲醛灌注，大鼠全身僵硬后，立即取出腦組織，采用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片后HE染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察各組新生大鼠腦組織病理變化。2）大鼠腦組織含水量檢測［8］：隨機(jī)取每組大鼠各6只，斷頭處死，快速取出腦，從矢狀縫切開，稱取新生大鼠右腦組織質(zhì)量為濕質(zhì)量。置于100℃烘箱中烘24 h，稱量記為干質(zhì)量。腦組織含水量（%）=（腦組織濕質(zhì)量-腦組織干質(zhì)量）/腦組織濕質(zhì)量×100%。3）大鼠腦組織MDA、SOD和GSP-Px測定：取剩余新生大鼠缺血側(cè)腦組織，沖洗除去殘血，用濾紙吸干后立即精確稱質(zhì)量，加入4℃預(yù)冷的生理鹽水制成10%組織勻漿，離心（4 000 r/min，10 min）后取上清液，-20℃保存?zhèn)溆?。?yán)格按照MDA、SOD和GSP-Px試劑盒操作說明檢測各指標(biāo)。4）Western blotting法檢測大鼠腦組織p-ERK、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)：取適量各組新生大鼠腦組織，加入預(yù)冷的蛋白裂解液于冰上裂解30 min，離心（4℃，12 000 r/min，10 min），取上清液-80℃保存?zhèn)溆?。BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，加入一抗，4℃孵育過夜。沖洗后加入二抗，室溫孵育2 h。沖洗后ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料用n表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦組織含水量比較 見表1。假手術(shù)組新生大鼠無神經(jīng)功能缺損癥狀，模型組新生大鼠在行走時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈、意識(shí)不清、無法正常行走等現(xiàn)象。與假手術(shù)組比較，模型組新生大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦組織含水量均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，谷紅中劑量組、谷紅高劑量組和ERK+谷紅組新生大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦組織含水量均顯著降低（P＜0.05）。與ERK組比較，ERK+谷紅組新生大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦組織含水量均顯著降低（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦組織病理變化比較 見圖1。假手術(shù)組新生大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞輪廓正常，中央有細(xì)胞核，核仁明顯。模型組神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，極性不清，細(xì)胞萎縮、核固縮，神經(jīng)細(xì)胞退化、壞死和凋亡，一些細(xì)胞表現(xiàn)出核凝結(jié)和間質(zhì)水腫，空泡變性和核結(jié)構(gòu)不清楚。谷紅高劑量組腦組織細(xì)胞明顯改善，形態(tài)接近假手術(shù)組，凋亡和壞死細(xì)胞較模型組顯著減少。ERK組腦組織細(xì)胞與模型組變化相似，細(xì)胞出現(xiàn)核萎縮等現(xiàn)象，ERK+谷紅組細(xì)胞形態(tài)較ERK組也顯著改善，壞死細(xì)胞減少。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦組織含水量比較（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦組織含水量比較（±s）

與假手術(shù)組比較，◇P＜0.05；與模型組比較，◆P＜0.05；與谷紅高劑量組比較，△P＜0.05；與ERK組比較，▲P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組谷紅低劑量組谷紅中劑量組谷紅高劑量組ERK組ERK+谷紅組n 6 6 6 6 6 6 6神經(jīng)功能缺損評(píng)分（分）0 3.74±0.27◇3.61±0.24 2.63±0.19◆1.02±0.08◆3.82±0.36 2.51±0.18◆△▲腦組織含水量（%）80.07±5.97 96.98±6.43◇90.04±6.59 88.31±6.51◆81.75±6.05◆98.43±7.26 88.97±5.02◆△▲

圖1 各組大鼠腦組織病理觀察（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠腦組織MDA、SOD和GSP-Px表達(dá)比較 見表2。與假手術(shù)組比，模型組新生大鼠腦組織MDA顯著升高（P＜0.05），SOD和GSP-Px活力顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，谷紅中劑量組、谷紅高劑量組和ERK+谷紅組新生大鼠腦組織MDA顯著降低，SOD和GSP-Px活力顯著升高（P＜0.05）。與ERK組比，ERK+谷紅組新生大鼠腦組織MDA顯著降低，SOD和GSP-Px活力顯著升高（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠腦組織ERK/Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組新生大鼠腦組織p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，谷紅中劑量組、谷紅高劑量組和ERK+谷紅組新生大鼠腦組織p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。與ERK組比較，ERK+谷紅組新生大鼠腦組織p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠腦組織MDA、SOD和GSP-Px表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠腦組織MDA、SOD和GSP-Px表達(dá)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組谷紅低劑量組谷紅中劑量組谷紅高劑量組ERK組ERK+谷紅組n 6 6 6 6 6 6 6 MDA（nmol/mg）1.52±0.25 5.46±1.15◇5.09±1.08 3.61±0.67◆2.21±0.28◆5.61±1.19 3.94±0.72△▲SOD（U/mg）17.85±1.63 5.72±1.05◇6.43±1.26 10.15±1.38◆14.98±1.57◆5.16±0.98 11.85±1.43△▲GSP-Px（U/mg）54.28±5.62 15.43±2.51◇17.15±2.68 32.85±4.19◆50.51±5.04◆14.02±2.48 28.26±2.92△▲

表3 各組大鼠腦組織p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠腦組織p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組谷紅低劑量組谷紅中劑量組谷紅高劑量組ERK組ERK+谷紅組n 6 6 6 6 6 6 6 p-ERK 1.12±0.13 0.10±0.01◇0.12±0.02 0.36±0.02◆0.91±0.10◆0.09±0.01 0.63±0.08◆△▲Nrf2 1.02±0.09 0.12±0.01◇0.13±0.02 0.37±0.03◆0.82±0.08◆0.11±0.02 0.54±0.05◆△▲HO-1 1.13±0.14 0.32±0.02◇0.33±0.03 0.42±0.04◆0.78±0.09◆0.26±0.03 0.51±0.04◆△▲

圖2 各組大鼠腦組織p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)

3討論

氧化應(yīng)激是腦損傷的主要機(jī)制之一。腦缺血缺氧可使抗氧化防御系統(tǒng)受損，氧自由基的產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡受到破壞，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)活性氧（ROS）累積，引起氧化應(yīng)激［9］。谷紅注射液可增加腦缺血再灌注（I/R）大鼠腦組織GSH-Px活性，降低LDH含量，對(duì)I/R大鼠發(fā)揮腦保護(hù)作用［10］。谷紅注射液可降低氧糖剝奪損傷大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO和MDA含量，高SOD和GSH-PX活性，改善細(xì)胞形態(tài)，減少缺氧誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞數(shù)量，其機(jī)制可能與增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力和抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)［11］。本研究結(jié)果顯示，新生大鼠在缺血缺氧后，神經(jīng)功能評(píng)分和腦組織含水量顯著升高，腦組織MDA顯著升高，SOD和GSP-Px活力顯著下降。谷紅注射液主要是由乙酰谷酰胺和紅花提取物制成的滅菌水溶液，紅花提取液中有效成分為紅花苷類和紅花黃色素，具有擴(kuò)張血管的作用，增加腦組織抗缺血缺氧能力；乙酰谷酰胺可經(jīng)血腦屏障維持神經(jīng)應(yīng)激能力，改善腦功能［12］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，谷紅注射液可降低膠質(zhì)細(xì)胞和海馬神經(jīng)元Caspase-3酶活性，抑制紅細(xì)胞聚集，從而降低全血黏度，還可提高纖維蛋白溶解酶活性，加快血栓溶解，增加腦血流量，改善腦循環(huán)［13］。本研究發(fā)現(xiàn)谷紅注射液干預(yù)后，可降低缺氧缺血新生大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦組織含水量、腦組織MDA含量，提高SOD和GSP-Px活力，提示谷紅注射液可通過提高抗氧化酶活性降低氧自由基對(duì)腦組織的損傷。

ERK/Nrf2/HO-1信號(hào)通路的激活可降低細(xì)胞或組織中的氧自由基，保護(hù)細(xì)胞或組織免受損傷。Nrf2作為亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族成員，機(jī)體受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，Nrf-2與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白發(fā)生解離后進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而促進(jìn)HO-1蛋白的表達(dá)，磷酸化的ERK可以促進(jìn)Nrf2激活［14-15］。HO-1對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，可催化血紅素產(chǎn)生膽綠素和鐵等物質(zhì)，膽綠素可形成膽紅素，二者是體內(nèi)強(qiáng)有力的自由基清除劑［16］。馬慧萍等研究發(fā)現(xiàn)，急慢性腦缺血大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分、梗死體積顯著增加，GSH-Px和SOD活力、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)降低，白楊素可激活Nrf2/HO-1通路，減輕急慢性腦缺血損傷，對(duì)海馬神經(jīng)損傷起保護(hù)作用［17］。本研究結(jié)果顯示，缺氧缺血新生大鼠腦組織蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，谷紅注射液干預(yù)后，p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。且與ERK抑制劑組比較，ERK抑制劑和谷紅注射液共同干預(yù)后，新生大鼠SOD和GSP-Px活力、p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)較均顯著升高，神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦組織含水量以及MDA含量均顯著降低，提示谷紅注射液可激活ERK/Nrf2/HO-1信號(hào)通路，促進(jìn)p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)降低了腦組織氧化應(yīng)激，進(jìn)而對(duì)缺氧缺血新生大鼠發(fā)揮腦保護(hù)作用。

綜上所述，谷紅注射液可降低缺氧缺血新生大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分，減輕腦水腫和病理學(xué)損傷，提高腦組織抗氧化酶活性，對(duì)缺氧缺血新生大鼠神發(fā)揮腦保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與激活ERK/Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)。