陳小蘭 鄭道國(guó) 徐群威 蘇麗麗

（浙江省臺(tái)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 317523）

缺血性心臟病嚴(yán)重威脅人類健康，其發(fā)病率呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)［1］。通過(guò)有效方法使缺血心肌重新獲得血液供應(yīng)可治療缺血性心臟病，但是血液再灌注會(huì)加劇原有心肌缺血性損傷，即發(fā)生心肌缺血再灌注損傷（MI/RI）［2］。近年來(lái)，中醫(yī)藥對(duì)MI/RI保護(hù)作用的研究是中西醫(yī)結(jié)合研究的切入點(diǎn)之一，采用中藥有效成分提取物或中藥復(fù)方對(duì)于治療MI/RI具有較好的療效［3］。因此，系統(tǒng)地篩選能有效治療該病的中草藥，并研究其作用機(jī)制，可發(fā)掘傳統(tǒng)中藥方劑的臨床實(shí)用價(jià)值，推動(dòng)中藥科學(xué)內(nèi)涵的發(fā)展。南葶藶子是十字花科植物播娘蒿的干燥成熟種子，在臨床中多用于治療心力衰竭、肺水腫等疾病，療效明顯［4］。研究發(fā)現(xiàn)，南葶藶子提取液可改善心力衰竭大鼠各項(xiàng)心功能指標(biāo)，保護(hù)心肌損傷［5］。目前，南葶藶子提取液對(duì)MI/RI發(fā)生時(shí)心肌自噬的影響還未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立MI/RI大鼠模型，觀察南葶藶子提取液對(duì)MI/RI大鼠心肌自噬的影響并探討其可能的作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步地治療相關(guān)心臟疾病的新藥研發(fā)提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 72只健康成年雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量160～240 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。大鼠飼養(yǎng)條件：光照12 h，室溫25～28℃，相對(duì)濕度45%，自由飲水和進(jìn)食。

1.2 試藥與儀器 南葶藶子水提液：取100 g南葶藶子，加入4倍量蒸餾水，70℃水浴提取3次，每次提取1 h，合并濾液濃縮至100 mL備用，每1毫升相當(dāng)于2 g原生藥，實(shí)驗(yàn)時(shí)用0.9%氯化鈉注射液配成所需濃度。果糖二磷酸鈉注射液，北京華靳制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20013086。乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。LC3Ⅰ和LC3Ⅱ抗體，美國(guó)Epitomics公司，貨號(hào)分別為ab52768、ab51739。Beclin-1抗體，美國(guó)CST公司，貨號(hào)D40C5。兔抗鼠B淋巴細(xì)胞瘤（Bcl-2）多克隆抗體（批號(hào)Nosc-509）。蛋白激酶p38（p38）抗體，美國(guó)CST公司，貨號(hào)D31C7。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）和p-ERK1/2抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology，批號(hào)分別為SC365058、SC365062。β-actin抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。JEM-1011透射電子顯微鏡，日本。

1.3 分組與給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及南葶藶子提取液低、中、高劑量組。陽(yáng)性對(duì)照組，按劑量100 mg/kg尾靜脈緩慢注射果糖二磷酸鈉［5］。南葶藶子水提液低、中、高劑量組分別按劑量5、10、20 g/（kg·d）尾靜脈緩慢注射南葶藶子水提液［6］。假手術(shù)組和模型組尾靜脈注射100 mg/kg 0.9%氯化鈉注射液。連續(xù)給藥3周。

1.4 模型制備 末次給藥結(jié)束后，參照文獻(xiàn)方法建立MI/RI模型，大鼠于術(shù)前12 h禁食，麻醉后固定四肢，并切開(kāi)氣管與動(dòng)物呼吸機(jī)相連接，逐步分離肌肉組織后找到冠狀動(dòng)脈左前降支，在分支起點(diǎn)約1～2 mm處采用5-0號(hào)絲線結(jié)扎，心電圖中的ST段抬高、缺血心肌區(qū)域的心肌壁發(fā)紺、膨出，表明MI形成。結(jié)扎30 min后松開(kāi)，將胸腔關(guān)閉再灌注120 min，心電圖中的ST段回落＞1/2，表明MI/RI模型成功建立［7］。假手術(shù)組只開(kāi)胸不結(jié)扎。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）血清LDH、CK-MB和cTnⅠ檢測(cè)。大鼠再灌注120 min后腹主動(dòng)脈取血，4℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液-20℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)上清液中CK-MB、LDH和cTnⅠ含量。2）心肌組織HE染色。大鼠取血后，迅速剪取心臟，預(yù)冷0.9%氯化鈉注射液沖洗。取適量心肌組織固定于10%甲醛溶液中，經(jīng)脫水、包埋制成石蠟切片，蘇木精和伊紅染色，光學(xué)顯微鏡觀察。剩余心肌組織-80℃保存?zhèn)溆谩?）心肌組織自噬小體觀察。參照文獻(xiàn)［8］方法，取心肌組織，2.5%戊二醛固定4 h，清洗后用鋨酸固定2 h，經(jīng)丙酮脫水、丙酮與包埋劑浸透、Epon 812樹(shù)脂包埋，超薄切片。用醋酸鈾、硝酸鉛雙染色20 min，透射電鏡觀察。4）心肌組織MDA和SOD檢測(cè)。取心肌組織稱質(zhì)量，制成心肌組織勻漿，4℃、3 500 r/min離心15 min，收集上清液-20℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)上清液中MDA和SOD含量。5）心肌組織蛋白檢測(cè)。采用Western blotting法測(cè)定心肌組織Beclin-1、LC3Ⅱ、Bcl-2、p38和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平。取心肌組織剪碎，加入RIPA裂解液置于冰上充分裂解，離心取上清液，BCA法測(cè)定蛋白含量。取適量蛋白，加入上樣緩沖液，100℃煮沸5 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗4℃孵育過(guò)夜。洗膜后，加入二抗室溫孵育1 h。經(jīng)ECL發(fā)光顯影后，以β-actin為內(nèi)參，用SensiAnsys凝膠系統(tǒng)分析其灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料用n表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 各組大鼠心電圖比較 見(jiàn)圖1，表1。與假手術(shù)組比，模型組大鼠心電圖ST段抬高（P＜0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及南葶藶子提取液中、高劑量組大鼠心電圖ST段降低（P＜0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，南葶藶子提取液低、中劑量組大鼠心電圖ST段抬高（P＜0.05）。南葶藶子不同劑量組之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.017，P＜0.05），心電圖ST段隨劑量增加呈下降趨勢(shì)。

圖1 各組大鼠心電圖變化

表1 各組大鼠心電圖ST段比較（mV，±s）

表1 各組大鼠心電圖ST段比較（mV，±s）

與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性對(duì)照組南葶藶子提取液低劑量組南葶藶子提取液中劑量組南葶藶子提取液高劑量組n 12 12 12 12 12 12 ST段0.18±0.05 0.57±0.11#0.31±0.07*0.49±0.10△0.41±0.09*△0.33±0.07*

2.2 各組大鼠血清LDH、CK-MB和cTnⅠ比較 見(jiàn)表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清LDH、CK-MB和cTnⅠ均升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及南葶藶子提取液中、高劑量組大鼠血清LDH、CKMB和cTnⅠ均降低（P＜0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，南葶藶子提取液低、中劑量組大鼠血清LDH、CK-MB和cTnⅠ均升高，且南葶藶子提取液高劑量組大鼠血清CK-MB降低（P＜0.05）。南葶藶子不同劑量組之間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1596.089、1390.122、33.028，P＜0.05），血清LDH、CK-MB和cTnⅠ隨劑量增加呈下降趨勢(shì)。

表2 各組大鼠血清LDH、CK-MB和cTnⅠ比較（±s）

表2 各組大鼠血清LDH、CK-MB和cTnⅠ比較（±s）

組 別n LDH（U/L）CK-MB（U/L）cTnⅠ（ng/L）假手術(shù)組模型組陽(yáng)性對(duì)照組南葶藶子提取液低劑量組南葶藶子提取液中劑量組南葶藶子提取液高劑量組12 12 12 12 12 12 863.25±23.17 1 933.47±61.52#950.72±32.48*1 891.54±50.26△1 429.18±38.46*△947.62±31.93*1 539.17±40.28 3 769.24±133.57#1 765.29±43.85*3 659.26±128.46△2 573.18±81.92*△1 698.27±42.19*△27.35±3.68 68.29±11.59#32.85±3.91*60.19±10.25△47.28±7.93*△34.18±4.05*

2.3 各組心肌組織病理學(xué)變化 見(jiàn)圖2。假手術(shù)中組心肌細(xì)胞大小均勻，邊界清晰。模型組大鼠心肌壞死，出現(xiàn)水腫，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，和輕度炎癥，心肌細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞間隙增大。陽(yáng)性對(duì)照組心肌細(xì)胞排列規(guī)整，細(xì)胞界限較為清晰，染色均勻。經(jīng)南葶藶子提取液干預(yù)后，隨著劑量增加心肌病變緩解，壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌水腫明顯減少，心肌細(xì)胞排列更為規(guī)整。

圖2 心肌組織病理學(xué)變化（200倍）

2.4 心肌組織自噬小體觀察 見(jiàn)圖3。假手術(shù)組心肌細(xì)胞細(xì)胞膜完整，細(xì)胞器形態(tài)正常。模型組大鼠心肌組織線粒體腫脹，出現(xiàn)大量自噬小體，空泡變性嚴(yán)重。陽(yáng)性對(duì)照組的自噬小體數(shù)量較少，且心肌細(xì)胞細(xì)胞膜較為完整。南葶藶子提取液組大鼠心肌組織隨著劑量增加，線粒體腫脹程度不斷減輕，自噬小體數(shù)量不斷減少。

圖3 各組心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察（400倍）

2.5 各組大鼠心肌組織MDA和SOD水平比較 見(jiàn)表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織MDA含量升高（P＜0.05），SOD活力降低（P＜0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及南葶藶子提取液中、高劑量組大鼠心肌組織MDA含量降低（P＜0.05），SOD活力升高（P＜0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，南葶藶子提取液低、中劑量組大鼠心肌組織MDA含量升高，SOD活力降低（P＜0.05）。南葶藶子不同劑量組之間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=395.481、322.516，P＜0.05），其中心肌組織MDA含量隨劑量增加呈下降趨勢(shì)，SOD活力隨劑量增加呈上升趨勢(shì)。

表3 各組大鼠心肌組織MDA和SOD水平比較（±s）

表3 各組大鼠心肌組織MDA和SOD水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性對(duì)照組南葶藶子提取液低劑量組南葶藶子提取液中劑量組南葶藶子提取液高劑量組n 12 12 12 12 12 12 MDA（nmol/mg）3.29±0.38 19.57±1.53#5.29±0.47*17.23±1.49△11.28±0.87*△5.41±0.45*SOD（U/mg）185.27±11.34 79.25±5.26#160.73±10.51*83.46±5.79*△128.71±7.18*△163.49±9.73*

2.6 各組自噬相關(guān)蛋白和MAPK/ERK1/2通路相關(guān)表達(dá)比較 見(jiàn)圖4、表4。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織Beclin-1、p38蛋白以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高（P＜0.05），Bcl-2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及南葶藶子提取液中、高劑量組大鼠心肌組織Beclin-1、p38蛋白以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低（P＜0.05），Bcl-2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，南葶藶子提取液低劑量組Beclin-1、p38及南葶藶子提取液不同劑量組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高，南葶藶子提取液低劑量組Bcl-2及南葶藶子提取液低、中劑量組p-ERK1/2降低（P＜0.05），南葶藶子不同劑量組Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-ERK1/2、p38之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.977、82.006、39.661、23.607，P＜0.05），其中B-eclin-1、p38蛋白以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值隨劑量增加呈下降趨勢(shì)，p-ERK1/2蛋白表達(dá)隨劑量增加呈上升趨勢(shì)。

圖4 自噬和MAPK/ERK1/2通路相關(guān)蛋白表達(dá)條帶

表4 各組自噬和MAPK/ERK1/2通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

表4 各組自噬和MAPK/ERK1/2通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性對(duì)照組南葶藶子提取液低劑量組南葶藶子提取液中劑量組南葶藶子提取液高劑量組n 12 12 12 12 12 12 Beclin-1 0.34±0.12 1.09±0.27#0.45±0.18*0.98±0.26△0.53±0.21*0.43±0.17*LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.20±0.10 1.96±0.25#0.34±0.13*1.86±0.24△1.33±0.21*△0.74±.19*△Bcl-2 0.96±0.25 0.28±0.10#0.49±0.21*0.29±0.13△0.37±0.16*0.45±0.19*p-ERK1/2 0.91±0.23 0.18±0.08#0.87±0.21*0.23±0.09△0.43±0.17*△0.79±0.19*p38 0.28±0.11 0.85±0.21#0.34±0.13*0.81±0.20△0.42±0.17*0.37±0.14*

3討論

MI/RI可增加心肌細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致心肌內(nèi)細(xì)胞酶釋放進(jìn)入血液，因此，血清心肌酶可用于判斷心肌損傷的嚴(yán)重程度［9］。血清LDH、CK-MB和CTnⅠ是臨床上常用的心肌損傷標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，MI/RI大鼠心電圖ST段顯著抬高，心肌組織細(xì)胞排列不整齊，出現(xiàn)水腫、炎癥等現(xiàn)象，LDH、CK-MB和cTnⅠ均升高，說(shuō)明MI/RI大鼠心肌細(xì)胞受到損傷。南葶藶子提取液干預(yù)后，心肌組織水腫、炎癥等現(xiàn)象得到改善，LDH、CK-MB和cTnⅠ降低，說(shuō)明其可減輕MI/RI對(duì)細(xì)胞膜的損傷，降低心肌酶釋放，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

自噬是溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器等過(guò)程的統(tǒng)稱，可維持心肌細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能。心肌缺血再灌注引起機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激過(guò)程中生成的活性氧可誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生［10］。氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，過(guò)量的氧自由基攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸使其脂質(zhì)過(guò)氧化。MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，其含量越高，說(shuō)明心肌組織損傷越嚴(yán)重。SOD是重要的抗氧化酶，可有效清除自由基，減輕自由基對(duì)心肌細(xì)胞或組織的損傷。本研究結(jié)果顯示，南葶藶子提取液可降低MI/RI大鼠心肌組織MDA含量，提高SOD活力，提示南葶藶子提取液可通過(guò)降低氧化應(yīng)激減輕自噬對(duì)MI/RI大鼠心肌損傷。Beclin-1在自噬過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，其水平高低可反映自噬活性［11］?？沟蛲龅鞍譈cl-2可與Beclin-1結(jié)合調(diào)控機(jī)體自噬水平［12］。細(xì)胞自噬發(fā)生過(guò)程中，LC3Ⅰ被剪切為L(zhǎng)C3Ⅱ，LC3Ⅱ參與細(xì)胞自噬泡的形成，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可反映自噬被激活的程度［13］。本研究結(jié)果顯示，南葶藶子提取液干預(yù)可降低MI/RI大鼠心肌組織自噬小體數(shù)量，Beclin-1蛋白水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，提示南葶藶子提取液可通過(guò)降低MI/RI大鼠心肌自噬，減輕心肌損傷。

缺血/再灌注過(guò)程引起心肌細(xì)胞凋亡。絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（MAPKs）是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控通路，主要包括p38和ERK1/2等通路。p38通路的激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而ERK1/2信號(hào)通路的激活可抑制細(xì)胞凋亡，增加調(diào)控。p38和ERK1/2信號(hào)通路參與心肌缺血/再灌注過(guò)程，影響心肌組織正常功能［14］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織p38蛋白水平升高，p-ERK1/2蛋白水平降低，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致［15］。南葶藶子提取液干預(yù)后，p38蛋白隨劑量增加呈下降趨勢(shì)，p-ERK1/2蛋白表達(dá)隨劑量增加呈上升趨勢(shì)，提示南葶藶子提取液可能通過(guò)作用p38和ERK1/2信號(hào)通路減輕MI/RI。

綜上所述，南葶藶子提取液可減輕心肌缺血/再灌注大鼠心肌自噬，保護(hù)心肌損傷，其作用機(jī)制可能與p38和ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)。