藺曉源 古 娟 鐘日君 張嘉倫 趙應(yīng)松 王 敏 劉杰民

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)國內(nèi)一流建設(shè)學(xué)科，湖南 長沙 410208；3.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002；4.貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽550002）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種反復(fù)發(fā)作的以腹痛、腹瀉和便血等癥狀和體征為主要臨床表現(xiàn)的特發(fā)性炎癥性腸?。?］。UC病因尚不清楚，研究認為其發(fā)病與遺傳、環(huán)境、感染、微生物群失調(diào)和免疫應(yīng)答等因素密切有關(guān)［2］。樹突狀細胞（DC）是功能最強大的抗原提呈細胞，也是激發(fā)機體免疫應(yīng)答反應(yīng)過程中的始動細胞［3］；激活的DC是導(dǎo)致UC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵啟動子［4］。目前UC的西醫(yī)治療多采用免疫抑制劑及微生態(tài)制劑等聯(lián)合用藥，雖有成效，但仍面臨副作用大、易復(fù)發(fā)等諸多問題難以解決。健脾益腸散是基于UC“本虛標實”的中醫(yī)病機組方的名老中醫(yī)（董菲洛教授）經(jīng)驗方，臨床治療UC安全有效，并能明顯改善患者機體的免疫功能［5］，且健脾益腸散治療UC的相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究榮獲2017年度貴州省科技進步二等獎。為了進一步明確健脾益腸散治療UC的免疫耐受機制，本研究從體外細胞角度觀察了健脾益腸散對DC細胞成熟標志CD83表達的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 10只SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量220～250 g，用于制備含藥血清。C57BL/6 小鼠，6～8周，雄性，體質(zhì)量18～25 g，用于分離DC細胞。動物均由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（湘）2014-002。

1.2 試藥與儀器 健脾益腸散（黃芪15 g，太子參15 g，白術(shù)12 g，白豆蔻6 g，木香6 g，敗醬草30 g，補骨脂20 g，芡實12 g，茯苓12 g，炙甘草6 g）中藥飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診中藥房，經(jīng)鑒定符合國家藥典標準。中藥湯液按傳統(tǒng)方法煎煮2次，第1次用蒸餾水浸泡30 min后武火煎開，再用文火煎煮30 min，過濾留取藥液；第2次煎煮待武火煮開后文火煎煮20 min，過濾留取藥液，將2次煎液混合后水浴鍋加熱濃縮成生藥含量為3 g/mL的藥液冰箱冷藏備用。RPMI 1640（Hyclone公司，SH30809.01）、胎牛血清（Gibco公司，10270-106）、rmGM-CSF（eBioscience，85-BMS325）、rmIL-4（RD 公司、404-ML-010）、CD1a（eBioscience，MA5-12526）、Fluorescein（FITC）-conjugated Affinipure Donkey Anti-Mouse（bioswamp，PAB 160025）、流式專用 Buffer（bioswamp，PAB180076）、脂多糖（LPS）（Sigma，L2630）、IL-10（RD，417-ML-005）、CD83兔抗多克隆抗體（abcam，ab170855）、蛋白質(zhì)Marker（Thermo，26634）、RIPA（強）組織細胞快速裂解液（bioswamp，PAB180006）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強型）（bioswamp，PAB180007）、YBR Green PCR試劑盒（KAPABiosystems，KM4101）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA，639505）。SW-CJ-2D超凈工作臺（蘇州金凈凈化設(shè)備公司）、311型CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司）、MLS-3781L-PC高壓滅菌鍋（日本Panasohic）、Allegra X-30多功能離心機（貝克曼庫爾特）、DMIL LED倒置熒光顯微鏡（Leica公司）、Moflo XDP分選型流式細胞儀（Beckman公司）、CytoFLEX S流式細胞儀（Beckman公司）、HT7700透射電鏡（日立）、mini protean 3 cell電泳儀（BIO-RAD）、MK3酶標儀（芬蘭雷勃）、Tanon-5200全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能）、T100-Thermal Cycler PCR儀（BIO-RAD）、Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）。

1.3 DC細胞培養(yǎng)與鑒定 將C57BL/6小鼠用拉頸法處死后依次浸入75%乙醇中消毒10 min，無菌條件下剝離出股骨和脛骨，剪斷骨頭兩端，露出內(nèi)腔。用1 mL注射器吸取1 mL RPMI 1640培養(yǎng)液，將骨髓沖入到干燥無菌培養(yǎng)皿中，每根長骨反復(fù)沖洗直至骨髓腔呈白色近透明。用吸管反復(fù)吹打沖洗下來的骨髓至完全分散，無菌200目濾網(wǎng)過濾。收集骨髓細胞懸液到離心管中，離心10 min后棄上清液。用2 mL紅細胞裂解液，4℃裂解3～5 min，裂解至溶液透亮后加入2倍以上體積的PBS，終止裂解。然后離心，PBS洗滌2次。用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2×108/L，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，加入添加20 μg/L的rmGM-CSF和10 μg/L的rmIL-4培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后全量換液，之后隔天半量換液。倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，培養(yǎng)7 d后收集細胞進行下一步實驗。DC細胞的鑒定：在無菌環(huán)境下，取EP管，各加入300 μL的單細胞懸液，CD1a標記，每管加入6 μL抗體，并設(shè)空標管。4℃孵育45 min后，PBS洗3次，300 μL流式Buffer重懸細胞，每管再加入3 μL熒光二抗［Fluorescein（FITC）-conjugated Affinipure Donkey Anti-Mouse］，4℃避光孵育45 min，PBS洗3次。染色完成后PBS稀釋樣本，調(diào)整細胞密度為1×107/mL左右。上流式分選型細胞儀分選，收集分選細胞。細胞如前染色后，400 μL流式Buffer重懸細胞，4℃避光保存，流式細胞儀上機檢測，使用CYEXPERT分析軟件進行分析。

1.4 含藥血清的制備 SD大鼠隨機分為兩組：中藥含藥血清組和空白血清組。中藥含藥血清組按臨床等效劑量3倍的健脾益腸散（13.6 mL/kg）灌胃，空白血清組灌胃等體積量蒸餾水，每日2次，連續(xù)3 d；末次灌胃結(jié)束后禁食，1 h后麻醉從腹腔采集動脈血，靜置3～4 h，3 000 r/min，4℃離心20 min，分離血清；置于56℃水浴中滅活30 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾，-80℃冷藏備用。

1.5 分組及干預(yù) 取生長狀態(tài)良好的細胞，胰酶消化后調(diào)節(jié)細胞濃度，接種于細胞培養(yǎng)板，分組后按以下方法進行干預(yù)?？瞻讓φ战M（不加任何刺激物質(zhì)）、模型組（加入LPS）、中藥含藥血清組（加入LPS和健脾益腸散含藥血清）、空白血清組（加入LPS和不含藥血清）、IL-10組（加入IL-10）。加入血清濃度為10%。24 h后分別收集細胞和上清，進行指標檢測。

1.6 指標檢測 Western blotting法檢測各組DC細胞CD83的蛋白表達；RT-PCR法檢測各組DC細胞CD83的基因表達，取對數(shù)生長的細胞接種于12孔板中，每孔加1 mL細胞懸液。根據(jù)RT-PCR的操作方法進行樣本總RNA的提取、cDNA第一條鏈的合成（總RNA中DNA的消除；總RNA中DNase1的消除；反轉(zhuǎn)錄：42℃，60 min；70℃，15 min；16℃，維持）和PCR擴增。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列見表1。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間的比較滿足正態(tài)性檢驗后，方差齊時采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，方差不齊時采用Tamhane′s T2法。不滿足正態(tài)性分布的采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 PCR引物情況

2結(jié)果

2.1 DC細胞形態(tài)特點及CD1a陽性細胞鑒定 見圖1～圖2。倒置熒光顯微鏡下觀察顯示，第3日時，可見排列緊密，聚集成團，表面光滑呈圓形的細胞；第5日時，細胞散開，體積變大；第7日時，部分細胞懸浮，貼壁細胞形態(tài)不規(guī)則，可見樹突狀分化。分選后的CD 1a陽性細胞經(jīng)流式細胞儀檢測其占總細胞量的92.00%以上，達到實驗要求。

圖1 DC細胞形態(tài)學(xué)觀察（200倍）

圖2 CD1a陽性細胞的特征性表型

2.2 健脾益腸散對DC細胞CD83蛋白表達的影響見表2，圖3。模型組DC細胞CD83蛋白表達較空白對照組顯著增多（P＜0.01）；中藥含藥血清組DC細胞CD83蛋白表達減少，與模型組和空白血清組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；IL-10組DC細胞CD83蛋白表達雖較空白對照組有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 健脾益腸散對DC細胞CD83 mRNA表達的影響 見表2，圖4。與空白對照組比較，模型組DC細胞CD83的mRNA表達明顯增多（P＜0.05）；中藥含藥血清組DC細胞CD83的mRNA表達減少，與模型組和空白血清組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；IL-10組DC細胞CD83的mRNA表達較空白對照組降低（P＜0.05）。

表2 各組DC中CD83蛋白和mRNA表達比較（±s）

表2 各組DC中CD83蛋白和mRNA表達比較（±s）

與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05；與中藥含藥血清組比較，*P＜0.05。

組別空白對照組模型組中藥含藥血清組空白血清組IL-10組CD83 mRNA 1.18±0.12 1.36±0.15#1.22±0.13△1.40±0.12*1.07±0.10#CD83蛋白0.44±0.05 0.82±0.09##0.61±0.07△0.86±0.10*0.38±0.04

圖3 各組DC細胞CD83蛋白免疫印跡電泳圖

圖4 各組DC細胞CD83 mRNA表達曲線圖（RT-PCR）

3討 論

DC細胞是目前所知道的功能最強且唯一能夠激活初始型T細胞的專職抗原提呈細胞，而腸內(nèi)DC細胞決定著免疫反應(yīng)的性質(zhì)和種類［6］。損傷腸黏膜屏障功能的因素均可導(dǎo)致UC的發(fā)生，結(jié)腸黏膜DC細胞浸潤的頻率與UC活動性炎癥的嚴重性顯著關(guān)聯(lián)［7］。曾敬清等證實了炎癥性腸病患兒腸黏膜組織中的DC表型分子DC-SIGN表達增強，由此介導(dǎo)DC細胞參與炎癥性腸病的正負免疫調(diào)節(jié)［8］。目前DC細胞功能障礙促使UC發(fā)展的機制主要與在炎癥性黏膜上維持T細胞反應(yīng)性及作為效應(yīng)細胞釋放炎性因子有關(guān)。

DC細胞的主要標志為CDla，經(jīng)體內(nèi)外抗原活化后高表達CD83，而體內(nèi)未經(jīng)抗原活化的DC及體外新鮮分離的DC則低表達CD83，因而CD83被認為是DC細胞充分成熟的標志［9］。根據(jù)DC細胞發(fā)育分化的不同階段，分為未成熟 DC（imDC）及成熟DC（mDC），不同成熟狀態(tài)的DC具有能夠正向或負向調(diào)節(jié)T細胞的免疫功能。imDC具有較強的抗原吞噬能力，以及很強的加工和處理抗原的能力，而提呈抗原并刺激初始T細胞活化的能力很弱，能夠誘導(dǎo)機體的中樞性和外周性免疫耐受，故在誘導(dǎo)免疫耐受中發(fā)揮重要作用。mDC可有效激活Th細胞免疫應(yīng)答，發(fā)揮細胞毒性T淋巴細胞效應(yīng)，此過程將攝取的抗原進行處理，并以復(fù)合物的形式遞呈到細胞表面，再通過DC表面的雙信號分子把抗原遞呈給初始T淋巴細胞，有效激活T細胞免疫應(yīng)答，在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。故在免疫耐受的過程中，DC細胞的一個重要機制可能是通過專職釋放免疫抑制因子，導(dǎo)致免疫應(yīng)答向免疫耐受方向發(fā)展［10］。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，促進imDC向mDC轉(zhuǎn)化的因子有LPS、淋巴細胞、中性粒細胞、免疫復(fù)合物等；抑制imDC向mDC轉(zhuǎn)化的因子有抑炎因子（如IL-10）、糖皮質(zhì)激素類、干細胞等［11］。有學(xué)者驗證了LPS具有促進DC向成熟方向分化的作用；也有研究表明，DC在受LPS刺激成熟過程中，DC共刺激分子的表達與LPS存在一定的劑量關(guān)系，隨著刺激濃度的增加表達量也隨之增加［12］。IL-10具有拮抗LPS促成熟作用，能降低DC表面分子的表達，從而可以誘導(dǎo)耐受性DC的產(chǎn)生［13］。筆者前期的研究顯示，健脾益腸散能促進UC模型大鼠血清IL-10含量升高［14］，推測其可通過拮抗LPS促DC成熟而達到UC免疫耐受的作用。

UC屬中醫(yī)學(xué)“泄瀉”“腸癖”等范疇，其本在于脾氣虧虛，其標在于氣滯、濕熱和血瘀［15］。王愛華教授也認為，UC的根本病機為本虛標實，脾虛失運為其本，濕熱、熱毒為其標，日久夾瘀，脾腎雙虧［16］。因此，針對此本虛標實之證治宜扶正祛邪、標本兼治。健脾益腸散方中黃芪補氣固表、斂瘡生肌、固腸御邪為君；太子參益氣健脾，白術(shù)健脾益氣、燥濕利水，白豆蔻化濕行氣，木香行氣止痛、抗菌止瀉，敗醬草清熱行瘀消癰，共為臣藥；補骨脂補腎止瀉，芡實益腎補脾止瀉，茯苓健脾滲濕，共為佐藥；甘草補脾益氣，緩急止痛，調(diào)和諸藥為使。前期研究發(fā)現(xiàn)，健脾益腸散可通過促進熱休克蛋白70的表達、降低CD40分子的表達而起到對UC大鼠結(jié)腸黏膜的免疫保護作用［17-18］。

本實驗結(jié)果顯示，LPS干預(yù)DC細胞后，其成熟標志CD83的蛋白和mRNA表達均較空白對照組增強，說明LPS誘導(dǎo)了DC細胞的成熟；IL-10干預(yù)DC細胞后，CD83的mRNA表達較空白對照組減弱，證實IL-10可抑制DC細胞向成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)化。健脾益腸散含藥血清干預(yù)LPS誘導(dǎo)的DC細胞后，CD83的蛋白和mRNA表達均較模型組降低，表明健脾益腸散含藥血清可抑制DC細胞的成熟。以上結(jié)果表明健脾益腸散治療UC的免疫耐受作用可能是通過抑制DC細胞的成熟狀態(tài)來實現(xiàn)。此外，本實驗的研究意義還在于體外成功分離出數(shù)量多、純度高、活性好的DC細胞，并采用流式細胞術(shù)對其特異性標志物CD 1a細胞進行鑒定，為后續(xù)體外研究DC細胞免疫機制相關(guān)疾病的發(fā)病及中藥干預(yù)奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。