薛巨坤 王博 王蓮萍

摘要：通過生物信息學(xué)方法對miR-398-3p基因家族進(jìn)行序列分析和靶基因預(yù)測。結(jié)果表明，大部分miR-398-3p基因分布在不同的染色體上，miR-398-3p序列在不同物種間具有高度的保守性。進(jìn)化分析結(jié)果表明，miR-398-3p基因家族的成員呈現(xiàn)為7個分支，個別物種miR-398-3p的不同成員具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系;miR-398-3p的靶基因具有超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、花粉特異性蛋白質(zhì)SF3、鋅指蛋白WIP2、C2H2型鋅指家族蛋白等功能，參與植物的生物和非生物脅迫及生長發(fā)育調(diào)控過程。

關(guān)鍵詞：miR-398-3p;生物信息學(xué);靶基因;植物抗逆

中圖分類號：Q7? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）14-0141-07

Abstract： In this paper， the miR-398-3p gene family were analyzed by bioinformatics method and the target genes were predicted. The results showed that most miR-398-3p genes were scattered on different chromosomes， and the miR-398-3p sequence was highly conserved among different species. The miR-398-3p gene family showed that the miR-398-3p gene was composed of seven branches， and the different members of miR-398-3p had a distant genetic relationship. The miR-398-3p family regulated superoxide dismutase[Cu-Zn]， pollen-specific protein SF3， zinc finger protein WIP2， C2H2 type zinc finger family protein and other respects， were involved in plant biological and abiotic stress and growth and development control process.

Key words： MiR-398-3p; bioinformatics; target gene; plant resistance

微小RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性小RNA（21～24個核苷酸），通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，在植物和動物的發(fā)育中起關(guān)鍵作用[1]。成熟的miRNA衍生自單鏈RNA轉(zhuǎn)錄，其含有不完全的莖-環(huán)二級結(jié)構(gòu)，其形成并加工成細(xì)胞核中的miRNA雙鏈體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，然后被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)起到一定的作用[2]。成熟的miRNA通過形成miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（miRNA-induced silencing complex，miRISC）與靶標(biāo)mRNA互補(bǔ)配對結(jié)合，并對其進(jìn)行剪切或抑制翻譯，實現(xiàn)對靶標(biāo)基因的負(fù)調(diào)控[3]。研究表明，miRNA具有調(diào)控生物體生長發(fā)育、激素分泌與信號傳導(dǎo)以及對外界環(huán)境脅迫的應(yīng)答能力[4]。

近年來，關(guān)于miRNA在植物脅迫中的作用機(jī)理有一定的研究。陸生植物在生長過程中會遭遇諸多不可預(yù)知的環(huán)境脅迫，如鹽堿、干旱、蟲害及病害的侵?jǐn)_。植物需要啟動自身特殊機(jī)制來應(yīng)對這些脅迫，已進(jìn)化出極為精細(xì)復(fù)雜的生理和分子調(diào)控機(jī)制。例如植物自身會調(diào)控某些miRNA的生成與表達(dá)，通過miRNA作用靶基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控基因的表達(dá)，并通過基因之間的作用，最終抵抗逆境[5]。在已知的眾多參與植物抗逆過程的miRNA中，miR398是第一個被發(fā)現(xiàn)受逆境脅迫負(fù)調(diào)控的miRNA，直接與脅迫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)相關(guān)。miR398在調(diào)節(jié)植物銅代謝平衡、應(yīng)答過量的銅、鐵、鎘等重金屬脅迫、蔗糖、臭氧、鹽害等其他非生物脅迫，以及病原菌生物脅迫中均扮演重要角色[6]。有研究表明，人參（Panax ginseng C.A.Mey）中miR398在環(huán)境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，通過miR398的表達(dá)水平逐步降低，進(jìn)而提高靶基因CSD的表達(dá)水平，可以提高人參應(yīng)對高鹽和高銅環(huán)境脅迫的能力[7]。杜馳等[8]研究發(fā)現(xiàn)花花柴[Karelinia caspia（Pall.）Less]在鹽脅迫過程中，短時間內(nèi)鹽脅迫會導(dǎo)致KcmiR398下降，致使KcCSD1表達(dá)量升高以應(yīng)對鹽脅迫。Raja等[9]發(fā)現(xiàn)小麥（Triticum

aestivum L.）miRNA的表達(dá)水平分別受紫外線輻射、連續(xù)光和熱的影響，約55%miRNA，包括控制參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和開花活化的miR398、miR528和miR156等下調(diào)表達(dá)，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，使小麥能夠抵抗非生物脅迫，尤其是高溫脅迫。Valdés-López等[10]在對菜豆（Phaseolus vulgaris）的研究中發(fā)現(xiàn)，由于缺氮或缺鐵并且銅的含量增加使得miR398與miR408表達(dá)下調(diào)，對植物抗逆起調(diào)控作用。有研究表明，miR398表達(dá)水平降低，而銅鋅超氧化物歧化酶水平升高，使葡萄風(fēng)信子（Muscari botryoides Mill.）和小麥能夠抵抗干旱脅迫[11，12];冬小麥的抗寒性是由miR398調(diào)控其靶基因CSD而發(fā)揮作用[13]。賀曉麗等[14]發(fā)現(xiàn)在miR398過表達(dá)煙草（Nicotiana tabacum L.）植株中，PR5的表達(dá)受到明顯的抑制，初步判斷二者之間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。由于PR5和CSD均屬于抗性基因，會應(yīng)對各種脅迫，因此番茄（Lycopersicon esculentum Mill）中的miR398下調(diào)表達(dá)起到抗逆作用。Lu等[15]發(fā)現(xiàn)高溫可以誘導(dǎo)擬南芥[Arabidopsis thaliana（L.）Heynh]miR398表達(dá)，使其靶基因CSD2下調(diào)表達(dá)，通過熱誘導(dǎo)型miR398對CSD2的下調(diào)是擬南芥熱應(yīng)激反應(yīng)基因表達(dá)和耐熱性所必需的，使擬南芥更加耐高溫。顏秦峰等[16]通過構(gòu)建miR398過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草，在分子水平上對其抗旱性進(jìn)行研究，通過轉(zhuǎn)miR398b T1代植株，在干旱條件下發(fā)現(xiàn)煙草的抗旱性增加，說明了miR398的表達(dá)促進(jìn)了植物的抗旱作用。Guo等[17]研究發(fā)現(xiàn)了椪柑（Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan）cre-miR398b和cre-CSD的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，表明miR398b對CSD的調(diào)控在體外保護(hù)椪柑中起重要作用。植物通過miR398的上調(diào)表達(dá)或下調(diào)表達(dá)對其抗逆進(jìn)行調(diào)控。研究不同植物中miR398的表達(dá)情況與抗逆的關(guān)系，對于植物抗逆調(diào)控機(jī)理研究具有重要的意義。

本研究利用生物信息學(xué)方法檢測了miR-398-3p在不同物種中的基因組定位情況并對其基因家族成員進(jìn)行同源性和靶基因預(yù)測分析，為進(jìn)一步研究miR-398-3p靶基因的功能和相關(guān)抗逆機(jī)制提供了重要的理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? miR-398-3p序列檢索及分析

從miRBase（http：//www.mirbase.org/）網(wǎng)站獲取31種植物的58條miR-398-3p基因成熟序列。

1.2? miR-398-3p基因家族成員的多序列比對及保守位點分析

利用在線工具Clustalw（http：//www.genome.jp/tools/clustalw/）對miR-398-3p基因家族的成熟序列進(jìn)行多序列比對和分析。

1.3? miR-398-3p基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用MEGA5.1軟件構(gòu)建miR-398-3p基因家族成員的成熟序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4? miR-398-3p靶基因的預(yù)測

以gma-miR-398（雙子葉植物大豆）和ghr-miR-398（雙子葉植物陸地棉）為研究對象利用psRNATarget（http：//plantgrn.noble.org/v1_psRNATarget/）和BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）軟件在線預(yù)測miR-398-3p靶基因。

2? 結(jié)果與分析

2.1? miR-398-3p基因家族及在基因組中的定位分析

利用生物信息學(xué)方法，在miRBase數(shù)據(jù)庫中在線檢索所有物種中的miR-398-3p，結(jié)果見表1。由表1可知，31個植物物種中存在miR-398-3p，大部分miR-398-3p基因分散在不同的染色體上，也有少部分miR-398-3p基因位于同一染色體上，如ath-miR398b、ath-miR398c、mtr-miR398a-3p、mtr-miR398b成熟序列分別位于擬南芥和蒺藜苜蓿的5號染色體上，vvi-miR398b和vvi-miR398c成熟序列都位于葡萄6號染色體上。此外，火炬松、南歐丹參、刺菜薊、無油樟、白菜、花生、小麥、陸地棉、甜橙、向日葵、煙草、高粱、甘藍(lán)miR-398-3p基因家族成員都只有1個拷貝，其余的都是多拷貝，如擬南芥miR-398-3p基因家族成員有3個拷貝、水稻miR-398-3p基因家族成員有2個拷貝。

2.2? miR-398-3p基因家族序列分析

利用在線工具Clustalw對miR-398-3p家族進(jìn)行成熟序列的比對，結(jié)果見圖1。由圖1可知，31個物種miR-398-3p成熟序列的相似度較高，保守序列為UGUUCAGGUCCCCC。在堿基方面，僅有ssl-miR-398、lus-miR398d、lus-miR398e、ppe-miR398b的一個堿基由U變成了C，火炬松的兩個堿基由UC變成了CA，ahy-miR398、lus-miR398c缺失了一個堿基U，這些可能由于進(jìn)化過程中的基因突變問題導(dǎo)致。在位置方面，白菜、節(jié)節(jié)麥的miR-398-3p基因保守序列均位于35個堿基處;向日葵和陸地棉的miR-398-3p基因保守序列位于68～84位的14個堿基處，其余的物種miR-398-3p基因保守序列位于100～150個堿基處，表明miR-398-3p在不同物種間具有高度的保守性，但堿基的位置有一定差異。

2.3? miR-398-3p基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析

利用MEGA5.1軟件采用鄰接法對miR-398-3p基因家族成員構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行分子進(jìn)化規(guī)律的研究，結(jié)果見圖2。由圖2可知，miR-398-3p基因家族的成員呈現(xiàn)7個分支。31個物種先由火炬松pta-miR398產(chǎn)生為兩大分支，無油樟atr-miR398單獨分支，而剩下的物種進(jìn)一步分為5個分支。無油樟的成熟序列miR-398-3p與其他物種的成熟序列miR-398-3p存在一個堿基的差異，導(dǎo)致了無油樟在進(jìn)化方面也與其他物種屬于不同的分支。而馬鈴薯stu-miR398a基因，不是聚在某幾個分支，而是分散在整個進(jìn)化樹中，是一個單獨的分支，與其他stu-miR398基因家族成員的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這說明miRNA基因可能存在特殊的進(jìn)化機(jī)制，需要進(jìn)一步研究。

2.4? miR-398-3p靶基因的預(yù)測

大豆含miR-398-3p基因拷貝數(shù)比較多，陸地棉miR-398-3p是單拷貝，二者是比較常見的物種。兩種植物都屬于雙子葉植物，利用這兩個物種的miR-398-3p進(jìn)行靶基因預(yù)測，有利于對miR-398-3p基因家族的靶基因進(jìn)行較詳細(xì)全面的分析。利用在線軟件psRNATarget和BLAST進(jìn)行miR-398-3p的靶基因預(yù)測，結(jié)果見表2。從表2可以看出，miR-398-3p基因家族靶基因的功能涉及范圍較廣，有zf-C2H2_4結(jié)構(gòu)域蛋白、C2H2型鋅指家族蛋白、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、花粉特異性蛋白質(zhì)SF3、鋅指蛋白WIP2、GATA型鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族等。在同一物種中，不同種類的miR-398-3p靶基因具有相同的功能，如大豆中靶基因TC421780和TC423529都具有花粉特異性蛋白SF3的功能;在不同物種中miR-398-3p的靶基因也具有相同的功能，如大豆的靶基因TC452415，陸地棉的靶基因TC267083，都具有Cu-Zn超氧化物歧化酶和超氧化物歧化酶的功能，說明miR-398-3p基因家族不僅序列在物種間高度保守， 有些靶基因功能也較保守。也有少數(shù)miR-398-3p的靶基因功能表現(xiàn)出物種特異性， 如GATA型鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族即為miR-398-3p在陸地棉中特有的靶基因。miR-398-3p的靶基因具有花粉特異性蛋白SF3、超氧化物歧化酶、銅鋅超氧化物歧化酶等功能，這些基因影響植物的生長發(fā)育，并在植物應(yīng)對在非生物和生物脅迫中產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用，說明miR-398-3p在植物中有廣泛的調(diào)控功能。

3? 討論

miR398可以參與植物的抗逆過程，在鹽堿、干旱、重金屬等環(huán)境下參與相關(guān)的調(diào)控，在不同植物的抗逆過程中起到了不同的作用。如Guan等[18]通過研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中成熟的miR398表達(dá)受熱脅迫誘導(dǎo)，通過靶基因（CSD1、CSD2和CCS）下調(diào)表達(dá)，抵御熱脅迫。研究發(fā)現(xiàn)在N缺乏時，擬南芥中的miR398被抑制來抵抗缺N的脅迫[19]。超氧化物歧化酶（SOD）在幾乎所有細(xì)胞中的抗氧化防御中起重要作用，并且被推測與植物對生物和非生物脅迫（如干旱、鹽、重金屬和病原體攻擊）的抗性密切相關(guān)[20]。在木薯（Manihot esculenta crantz）中，由于氧化損傷造成的環(huán)境脅迫，轉(zhuǎn)基因木薯顯示細(xì)胞溶質(zhì)Cu/Zn SOD和過氧化物酶體CAT1表達(dá)增加，表現(xiàn)出抗其他非生物脅迫的抗性[21]。此外還發(fā)現(xiàn)一些miRNA受脅迫上調(diào)或下調(diào)，意味著它們可以在植物對非生物和生物脅迫的抗性中起重要作用，如在缺水的條件下，豌豆（Pisum sativum Linn）根和芽中miR398a/b表達(dá)下調(diào)，其潛在的靶基因超氧化物歧化酶（CSD1）的上調(diào)表達(dá)，在豌豆抵抗缺水脅迫反應(yīng)中起作用[22]。并且miR398在一些豆類植物中也能夠起到抗逆的作用，如miR398b介導(dǎo)的CSD和Nod19的上調(diào)表達(dá)與常見的豆類植物在對在非生物和生物脅迫中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)[23]。Chen等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中miR398下調(diào)表達(dá)，兩個靶基因CSD1和CSD2分別上調(diào)表達(dá)，提高了擬南芥冷凍耐受性。此外miR398可以調(diào)控PetE2基因?qū)?種主要葉綠體銅蛋白、質(zhì)體蛋白、CCS1和Csd2的表達(dá)與擬南芥體內(nèi)銅水平聯(lián)系起來[25]。植物在某種礦物質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時，其他營養(yǎng)物質(zhì)的代謝將被調(diào)整以保持適當(dāng)?shù)纳L發(fā)育。研究表明，在擬南芥中，銅（Cu）缺乏誘導(dǎo)miR397、miR398、miR408和miR857表達(dá)并調(diào)控銅蛋白的下調(diào)表達(dá)來抵御營養(yǎng)素不平衡的脅迫[26]。上述研究均表明，miR398大多通過調(diào)控其靶基因CSD1、CSD、CCS1等的表達(dá)對植物抗逆起重要作用。通過軟件也預(yù)測到了miR-398-3p的靶基因具有銅鋅超氧化物歧化酶、SOD等的功能，與植物抗逆相關(guān)。此外，Chen等[27]研究發(fā)現(xiàn)在玉米種子萌發(fā)過程中miR398上調(diào)表達(dá)，說明miR398在種子萌發(fā)和植物生命周期中起關(guān)鍵作用;也預(yù)測到了miR-398-3p的靶基因也具有花粉特異性蛋白SF3的功能，說明miR-398-3p可能參與植物的生長發(fā)育調(diào)控過程，關(guān)于發(fā)育相關(guān)的miR-398-3p靶基因功能還需要進(jìn)一步研究。

4? 結(jié)論

本研究通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)31種植物中存在miR-398-3p序列，大部分miR-398-3p基因分散在不同的染色體上，也有少部分miR-398-3p基因位于同一染色體上，miR-398-3p序列在不同物種間具有高度的保守性，但堿基位置有一定差異。進(jìn)化分析表明，miR-398-3p基因家族的成員呈現(xiàn)7個分支，個別物種miR-398-3p的不同成員具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系;靶基因預(yù)測表明，miR-398-3p的靶基因具有超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、鋅指蛋白WIP2、C2H2型鋅指家族蛋白、花粉特異性蛋白質(zhì)SF3等功能。

參考文獻(xiàn)：

[1] BOUCH? N.New insights into miR398 functions in Arabidopsis[J].Plant signaling & behavior，2010，5（6）：684-686.

[2] EAMENS A L，AGIUS C，SMITH N A，et al. Efficient silencing of endogenous microRNAs using artificial microRNAs in Arabidopsis thaliana[J].Mol Plant，2011，4（1）：157-170.

[3] 劉? 萌，周曉陽.miRNA在調(diào)節(jié)植物抗逆等生理功能中的作用[J].山東林業(yè)科技，2011（2）：102-105.

[4] 馬圣運(yùn)，白? 玉，韓? 凝，等.miRNA生物合成及其功能研究的新發(fā)現(xiàn)[J].遺傳，2012，34（4）：383-388.

[5] 曾幼玲，楊瑞瑞.植物miRNA的生物學(xué)特性及在環(huán)境脅迫中的作用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，49（19）：3671-3682.

[6] 丁艷菲，王光鉞，傅亞萍，等.miR398在植物逆境脅迫應(yīng)答中的作用[J].遺傳，2010，32（2）：129-134.

[7] 李躬軍.MiR398在人參高鹽、高銅脅迫中的調(diào)控作用[D].長春：吉林大學(xué)，2016.

[8] 杜? 馳，廖茂森，張? 霞，等.鹽脅迫下花花柴miR398對Cu/Zn超氧化物歧化酶基因的調(diào)控研究[J].西北植物學(xué)報，2014，34（4）：682-688.

[9] RAJA R，SRIDHAR M D，SAFIUR R M，et al.Deep sequencing of wheat sRNA transcriptome reveals distinct temporal expression pattern of miRNAs in response to heat，light and UV[J].Scientific reports，2016，6（39373）：1-15.

[10] VALD?S-L?PEZ O，YANG S S，APARICIO-FABRE R，et al. MicroRNA expression profile in common bean（Phaseolus vulgaris） undernutrient deficiency stresses and manganese toxicity[J].New phytologist，2010，187（3）：805-818.

[11] VALLABHI G，KETAN P，NGLE S，et al.Analysis of biochemical variations and microRNA expression in wild （Ipomoea campanulata） and cultivated （Jacquemontia pentantha） species exposed to in vivo water stress[J].Physiol Mol Biol Plants，2014，20（1）：57-67.

[12] AMANDEEP K，OM PRAKESH G，NAND L M，et al. Comparative temporal expression analysis of MicroRNAs and their target genes in contrasting wheat genotypes during osmotic stress[J].Appl Biochem Biotechnol，2017，181（2）：613-626.

[13] 梅? 琳.冬小麥抗寒相關(guān)4種miRNAs的克隆及表達(dá)特征分析[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[14] 賀曉麗，劉? 萍，欒雨時.番茄MIR398基因的克隆及其在煙草中的表達(dá)分析[J].植物生理學(xué)報，2015， 51（12）：2163-2168.

[15] LU X，GUAN Q，ZHU J. Downregulation of CSD2 by a heat-inducible miR398 is required for thertnotolerance in Arabidopsis[J].Plant signaling & behavior，2013，8（8）：e24952.

[16] 顏秦峰，李科友，石振楠，等.過表達(dá)miR398對煙草抗旱性的影響[J].北方園藝，2013（13）：111-116.

[17] GUO R，CHEN X，LIN Y，et al.Identification of novel and conserved miRNAs in leaves of in vitro grown citrus reticulata "Lugan" plantlets by solexa sequencing[J].Front Plant Sci，2015，6：1212.

[18] GUAN Q，LU X，ZENG H，et al.Heat stress induction of miR398 triggers a regulatory loop that iscritical for thermo tolerance in Arabidopsis[J].The plant journal，2013，74（5）：840-851.

[19] LIANG G，HE H，YU D Q.Identification of nitrogen starvation-responsive MicroRNAs in Arabidopsis thaliana[J].PLoS One，2012，7（11）：e48951.

[20] WANG X，ZHANG H，GAO Y，et al.Characterization of Cu/Zn-SOD enzyme activities and gene expression in soybean under low nitrogen stress[J].J Sci Food Agric，2016，96（8）：2692-2697.

[21] XU J，DUAN X G，YANG J，et al.Coupled expression of Cu/Zn-superoxide dismutase and catalase in cassava improves tolerance against cold and drought stresses[J].Plant signaling & behavior，2013，8（6）：e24525.

[22] JOVANOVI [C] ?，STANISAVLJEVI [C] N，MIKI [C] A，et al.Water deficit down-regulates miR398 and miR408 in pea （Pisum sativum L.）[J].Physiol Biochem，2014，83：26-31.

[23] NAYA L，PAUL S，VALD?S-L?PEZ O，et al.Regulation of copper homeostasis and biotic interactions by MicroRNA 398b in common bean[J].PLoS One，2014，9（1）：e84416.

[24] CHEN Y，JIANG J，SONG A，et al.Ambient temperature enhanced freezing tolerance of Chrysanthemum dichrum CdICE1 Arabidopsis via miR398[J].BMC biology，2013，11：121.

[25] JUSZCZAK I，BAIER M.The strength of the miR398-Csd2-CCS1 regulon is subject to naturalvariation in Arabidopsis thaliana[J].FEBS letters，2012，586（19）：3385-3390.

[26] LIANG G，AI Q，YU D q.Uncovering miRNAs involved in crosstalk between nutrient deficiencies in Arabidopsis[J].Scientific reports，2015，5：11813.

[27] CHEN T T，ZHANG H，JIANG C，et al.Deep sequencing of maize small RNAs reveals a diverse set of MicroRNA in dry and imbibed seeds[J].PLoS One，2013，8（1）：e55107.