張喬會(huì) 黃晶晶 熊坤

摘要：以湖北海棠[Malus hupehensis（Pamp.）Rehd]果實(shí)為原料，采取醇提法提取多酚，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，響應(yīng)面模型R2=0.990 4，P<0.001，模型對(duì)試驗(yàn)實(shí)際情況擬合較好，顯著性高。結(jié)果表明，優(yōu)化后的提取工藝參數(shù)為提取溶劑乙醇濃度61%，提取時(shí)間3.0 h，液料比21∶1，提取溫度85 ℃，并在此工藝參數(shù)條件下，湖北海棠果實(shí)提取液中多酚含量平均值為11.89 mg/g。

關(guān)鍵詞：湖北海棠（Malus hupehensis（Pamp.）Rehd）;多酚;提取;響應(yīng)面

中圖分類(lèi)號(hào)：S132? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）14-0117-05

Abstract： Polyphenols extracted from the fruit of Malus hupehensis（Pamp.）Rehd. On the basis of single factor experiments，the optimum conditions for the extraction of the polyphenols were obtained through Box-Benhnken center-united experiment design and response surface methodology. Response surface model R2 was 0.990 4，P<0.001，the model was highly significant and fitted well with the actual situation of the test. The results showed that the optimum conditions of extraction of the polyphenols were as follows： ethanol concentration 61%，time 3.0 h， liquid to raw material ratio 21∶1， temperature 85 ℃. Under this condition，the maximal yield of polyphenols was up to 11.89 mg/g.

Key words： Malus hupehensis（Pamp.）Rehd; polyphenols; extraction; response surface methodology

湖北海棠[Malus hupehensis（Pamp.）Rehd]屬薔薇科蘋(píng)果屬植物[1]，分布于湖北等黃河以南地區(qū)的19個(gè)省區(qū)[2]。湖北海棠抗白絹病和白紋羽病，耐澇性、耐旱性較強(qiáng)，抗氣溫變化范圍大，可以耐受-28～40 ℃的氣溫變化，在中國(guó)南方地區(qū)資源蘊(yùn)藏量較大[3]。湖北海棠枝葉及根等組織部位化學(xué)成分豐富，已有學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了一定的研究，如葉以含有多酚[4]、黃酮類(lèi)物質(zhì)[5，6]、根皮苷及礦物質(zhì)等。從湖北海棠中提取的天然產(chǎn)物如黃酮類(lèi)物質(zhì)等具有降低血糖[7，8]、抗脂質(zhì)過(guò)氧化[9]、抗氧化[10]、抗骨質(zhì)疏松[11，12]等作用。其果實(shí)作為植物的組成部分，也應(yīng)含有相似的成分，具有相似的生理功能。但湖北海棠果實(shí)小而多，味酸澀，目前對(duì)其開(kāi)發(fā)利用極少，資源浪費(fèi)嚴(yán)重。本研究以湖北海棠果實(shí)為原料，提取其中的酚類(lèi)物質(zhì)，探討利用響應(yīng)面法[13]優(yōu)化了其提取工藝，為其開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 原料及試劑

湖北海棠果實(shí)采自湖北省恩施土家族苗族自治州，洗凈后80 ℃烘干，粉碎過(guò)80目篩備用。

沒(méi)食子酸、無(wú)水乙醇、酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鐵氰化鉀等均為分析純。

1.2? 儀器設(shè)備

GL型粉碎機(jī)、FA2104型電子天平、SHZ-III型循環(huán)水式多用真空泵、UVWIN5型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、HWS-12型恒溫水浴鍋、R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、HWS-12型恒溫水浴鍋、TD5A型臺(tái)式低速離心機(jī)、DZF型真空干燥箱、202-1A型電熱恒溫干燥箱。

1.3? 方法

1.3.1? 多酚的提取? 利用多酚易溶解于醇等極性強(qiáng)溶劑的特性，使用50%～90%乙醇溶液進(jìn)行提取[14]，將采集得到的果實(shí)烘干粉碎，過(guò)80目篩，取一定量的果實(shí)粉末放入三角瓶中，按一定比例加入一定量的50%～90%乙醇溶液，在一定的溫度下進(jìn)行醇提。

1.3.2? 多酚的檢測(cè)? 采用灑石酸亞鐵比色法，即按GB8313.87方法[15]，吸取1 mL待測(cè)液放入25 mL的棕色容量瓶中，加入4 mL去離子水，5.0 mL的酒石酸亞鐵溶液，搖勻。用pH 7.5磷酸緩沖液稀釋至刻度，搖勻靜置15 min在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算多酚含量。

1.3.3? 湖北海棠果實(shí)多酚提取的單因素試驗(yàn)

1）提取溫度。設(shè)定提取液料比20∶1、乙醇濃度60%、提取時(shí)間1.5 h，分別在50、60、70、80、90 ℃的溫度下水浴浸提，在該條件進(jìn)行試驗(yàn)，考察不同提取溫度對(duì)湖北海棠果實(shí)多酚提取的影響。

2）料液比。設(shè)定乙醇濃度60%、提取時(shí)間1.0 h、提取溫度70 ℃，分別按液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1加入提取液進(jìn)行提取試驗(yàn)，考察不同料液比對(duì)湖北海棠果實(shí)多酚提取的影響。

3）提取時(shí)間。設(shè)定提取液料比20∶1、乙醇濃度60%、提取溫度70 ℃，分別在水浴條件下浸提0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，考察不同提取時(shí)間對(duì)湖北海棠果實(shí)多酚提取的影響。

4）乙醇濃度。設(shè)定提取料液比1∶15、提取時(shí)間1.0 h、提取溫度70 ℃，分別用濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液作為提取液，考察不同濃度乙醇提取液對(duì)湖北海棠果實(shí)多酚提取的影響。

1.3.4? 湖北海棠果實(shí)多酚提取的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)? 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，參考文獻(xiàn)[16，17]，運(yùn)用Design expert 7. 1軟件程序，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[5，15]，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析法，以提取溫度（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）、乙醇濃度（D）為自變量，以提取液中多酚含量為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)曲面分析（Response surface analysis，RSA）對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.4? 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理分別采用Microsoft Excel、Design Expert 7.1等軟件進(jìn)行。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1? 提取溫度? 不同提取溫度對(duì)湖北海棠果實(shí)多酚提取液中多酚含量的影響如圖1所示。隨著提取溫度升高，多酚含量逐漸升高，當(dāng)溫度為80 ℃時(shí)含量達(dá)到最高，然后隨著溫度的增加，含量逐漸下降，這可能是由于提取溫度過(guò)高，使多酚類(lèi)物質(zhì)氧化變性等。

2.1.2? 液料比? 不同液料比對(duì)湖北海棠果實(shí)多酚提取得率的影響如圖4所示。結(jié)果表明，提取液中多酚含量隨著液料比的增加而升高，當(dāng)液料比達(dá)到20∶1時(shí)，得率達(dá)到最高，隨后繼續(xù)增加液料比，多酚含量降低，這可能是由于液料比達(dá)到20∶1時(shí)，果實(shí)多酚溶出達(dá)到最大，之后隨著料液比的增加，反而稀釋了溶液，從而使得提取液中多酚含量的降低。

2.1.3? 提取時(shí)間? 提取時(shí)間對(duì)湖北海棠果實(shí)多酚得率的影響如圖2所示。隨提取時(shí)間延長(zhǎng)，湖北海棠果實(shí)提取液中多酚含量不斷升高，當(dāng)提取2.0 h后，增加的趨勢(shì)略有降低，可能是隨著提取時(shí)間的增加，在加熱的條件下，部分多酚類(lèi)物質(zhì)發(fā)生了氧化反應(yīng)等[18]。

2.1.4? 乙醇濃度? 提取溶劑乙醇濃度對(duì)湖北海棠果實(shí)總多酚提取得率的影響如圖3所示。結(jié)果表明，隨著乙醇濃度的增加，提取液中多酚含量逐漸升高，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)，其含量達(dá)到最高，然后隨著乙醇濃度的增加，提取液中多酚含量逐漸下降，乙醇濃度過(guò)高不利于多酚類(lèi)物質(zhì)的析出，并且會(huì)使蛋白質(zhì)等生物大分子變性沉淀，阻礙多酚類(lèi)物質(zhì)從組織細(xì)胞向溶劑中擴(kuò)散。

2.2? 湖北海棠果實(shí)多酚提取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1? 響應(yīng)面模型回歸分析? 以提取溫度（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）、乙醇濃度（D）為變量，以提湖北海棠果實(shí)提取液中多酚含量為響應(yīng)值，按響應(yīng)面軟件Design expert 7.1提供設(shè)計(jì)的組合進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

采用Design expert 7.1軟件程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到湖北海棠果實(shí)多酚含量的回歸方程如下：y=11.34+0.35A+0.20B+0.33C+0.31D-0.035AB+0.27AC+0.015AD-0.052BC-0.057BD-0.13CD-0.45A2-0.53B2+0.061C2-0.80D2。

對(duì)擬合的二次模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。F為88.06，多元相關(guān)系數(shù)為R2=0.990 4，預(yù)測(cè)R2=0.944 6，調(diào)整R2adj=0.979 1，說(shuō)明模型對(duì)試驗(yàn)實(shí)際情況擬合較好;P<0.001（P<0.05視為模型擬合顯著），表明該模型高度顯著，可用來(lái)進(jìn)行提取湖北海棠多酚響應(yīng)值的預(yù)測(cè)。

對(duì)模型中回歸系數(shù)的顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)分析，結(jié)果如表4所示。因素A、B、C、D與提取液中多酚含量的線(xiàn)性效應(yīng)顯著;因素AC、CD對(duì)多糖提取率的交互效應(yīng)顯著;因素A2、B2、D2對(duì)多糖提取率的曲面效應(yīng)極顯著;而因素AB、AD、BC、BD對(duì)多糖提取率的交互效應(yīng)不顯著。4個(gè)因素均不同程度地對(duì)響應(yīng)值產(chǎn)生顯著或極顯著的影響。

2.2.2? 響應(yīng)面圖形分析? 根據(jù)回歸方程，作出響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖，考察擬合響應(yīng)曲面的形狀，提取溫度、料液比、提取時(shí)間和乙醇濃度對(duì)湖北海棠果實(shí)提取液中多酚含量的影響，如圖5所示，等高線(xiàn)的形狀可以反映出交互相的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。由二次響應(yīng)面回歸模型方差分析及響應(yīng)面圖形及結(jié)合單因素分析可知，提取時(shí)間及提取溫度響應(yīng)明顯，乙醇濃度及提取時(shí)間交互響應(yīng)明顯。

2.2.3? 最佳閃提工藝條件的確定? 通過(guò)Design Expert 7.1軟件對(duì)湖北海棠果實(shí)多酚提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步得到較優(yōu)工藝參數(shù)為提取溫度85.2 ℃，液料比21.12∶1，提取時(shí)間3.0 h，乙醇濃度61.75%，在此條件下，湖北海棠果實(shí)提取液中多酚含量預(yù)測(cè)值為11.96 mg/g。為便于試驗(yàn)操作，在實(shí)際操作中將以上工藝參數(shù)修正為提取溶劑乙醇濃度61%，提取時(shí)間3.0 h，液料比21∶1，提取溫度85 ℃，并在此工藝參數(shù)條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得湖北海棠果實(shí)提取液中多酚含量平均值為11.89 mg/g，與預(yù)測(cè)值相差很小，說(shuō)明該模型與實(shí)際擬合度良好，結(jié)果可靠，優(yōu)化數(shù)據(jù)可信，可作為提取優(yōu)化參數(shù)。

3? 結(jié)論

以湖北海棠果實(shí)為原料，采取醇提法提取多酚，提取時(shí)間及提取溫度響應(yīng)明顯，乙醇濃度及提取時(shí)間交互響應(yīng)明顯。提取優(yōu)化工藝參數(shù)為提取溶劑乙醇濃度61%，提取時(shí)間3.0 h，液料比21∶1，提取溫度85 ℃，并在該工藝參數(shù)條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得湖北海棠果實(shí)提取液中多酚含量平均值為11.89 mg/g。

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