王開成

摘要：采用PDA培養(yǎng)基和PD培養(yǎng)基，對西瓜病株病原菌進(jìn)行分離、培養(yǎng)，經(jīng)致病性測定，形態(tài)學(xué)及rDNA-ITS測序，鑒定其致病菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。采用菌絲生長速率法測定85%氨基寡糖素和97%咪鮮胺對西瓜尖孢鐮孢菌的共毒系數(shù)。結(jié)果顯示，85%氨基寡糖素∶97%咪鮮胺=3∶1時，增效作用最好，共毒系數(shù)為167.88，對西瓜枯萎病菌菌絲具有很好的抑制效果。

關(guān)鍵詞：西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）;殺菌劑;聯(lián)合作用;混配

中圖分類號：S436.5? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）14-0059-03

Abstract： Pathogen of watermenlon wilt disease was isolated and cultured on PDA and PD， which was indentified was Fusarium oxysporum Schlecht by analysis of morphological characteristics and rDNA-ITS sequence and pathogenic determination. The co-toxicity coefficient of 85% oligosaccharins and 97% prochloraz mixed against Fusarium oxysporum were tested in lab by mycelium growth rate method， respectively. The results showed that synergistic inhibition best when 85% oligosaccharins and 97% prochloraz combinations mixed by 3∶1， co-toxicity coefficient was 167.88， obviously inhibitory against the pathogen.

Key words： Fusarium oxysporum; fungicides; combined action; mixture

西瓜為葫蘆科西瓜屬植物，其果瓤脆多汁，營養(yǎng)豐富，堪稱“瓜中之王”，是世界第五大果品[1]。近年來隨著西瓜栽培面積和需求量的不斷增加，重茬、抗病品種較少等原因，西瓜土傳病害種類增多且日趨加重[2]，致使西瓜生產(chǎn)中的問題也日趨凸顯，尤以西瓜枯萎病發(fā)生較為普遍。目前防治西瓜枯萎病尚無特別有效的藥劑。于2016—2017年，在海南陵水潤達(dá)設(shè)施西瓜基地發(fā)現(xiàn)西瓜萎蔫死苗現(xiàn)象，為明確該病的病原菌，本研究對引起該萎蔫死苗病害的病原菌進(jìn)行了分離、鑒定和藥劑防治。

本試驗防治藥劑選擇氨基寡糖素和咪鮮胺。氨基寡糖素是從海洋甲殼類動物外殼中提取的殼聚糖通過生物酶解工程制備而來的新型生物制劑，通過誘導(dǎo)植物體提高自身對外界的免疫力，從而抗病、抗逆（寒害、干旱），促進(jìn)作物健康生長，是一類新型多功能植物免疫誘抗劑。咪鮮胺是一種高效、廣譜、低毒的甾醇脫甲基化抑制劑，其作用方式獨特，可通過與細(xì)胞色素P450羊毛甾醇生物合成必需酶14α-脫甲基酶（CYP51）的血紅素鐵相互作用而抑制真菌的生長，對多種真菌性病害有效。本研究旨在探尋兩類作用機理不同的殺菌劑（免疫誘抗劑和咪唑類殺菌劑）的最佳混配比例，從而達(dá)到延長殺菌劑使用壽命、提高藥效、降低使用成本、改善質(zhì)量的目的。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試植株? 樣本來源于海南省陵水縣英州鎮(zhèn)陵水潤達(dá)公司設(shè)施西瓜（小型西瓜-美月）病株。

1.1.2? 供試培養(yǎng)基? 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖（PD）液體培養(yǎng)基。

1.1.3? 供試殺菌劑? 85%氨基寡糖素原藥，海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司;97%咪鮮胺原藥，湖北晟隆化工有限公司。

1.2? 病原菌分離純化及致病性測定

從患病西瓜植株發(fā)病部位的病健交界處切取5 mm×5 mm的組織塊，經(jīng)75%乙醇消毒，在無菌水中漂洗3次后將組織塊移到PDA平板中，在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。待長出菌落后，通過挑取菌落邊緣菌絲體進(jìn)行純化和轉(zhuǎn)接培養(yǎng);將純化的菌種HNXG1601接種到液體培養(yǎng)基（PD）中，28 ℃，125 r/min的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)6～7 d后，用雙層紗布過濾，離心，用血球計數(shù)板計算菌懸液濃度，并用無菌水對菌懸液進(jìn)行稀釋，配制成含量為106個孢子/mL的菌懸液，選擇傷根法進(jìn)行接種。設(shè)置3次重復(fù)，每次10株，接種后的植株置于26～28 ℃玻璃柜中，保濕。待接種植株發(fā)病后進(jìn)行發(fā)病調(diào)查記錄;并對接種發(fā)病的植株進(jìn)行病原菌的再次分離和鑒定[3]。

1.3? 病原菌鑒定

挑取純化好的HNXG1601菌絲在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，記錄菌落形態(tài)，依據(jù)分生孢子梗、分生孢子形態(tài)特征、大小及其特性鑒定。基因組DNA的提取和純化采用CTAB法進(jìn)行，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，并利用Blast與GenBank上已發(fā)表基因進(jìn)行同源性比對。

1.4? 毒力測定

采用菌絲生長速率法[3]，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，選擇各藥劑適當(dāng)?shù)?個濃度（表1），將配制好的供試藥劑母液按照設(shè)定的濃度比例加入到已融化并冷卻至45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，充分混勻后分別倒入直徑9 cm的滅菌培養(yǎng)皿中，制成系列濃度的含藥PDA平板。以不加藥劑但含等量無菌水的PDA平板為對照。接入直徑5 mm的菌餅，25 ℃恒溫培養(yǎng)，每處理設(shè)3次重復(fù)。采用十字交叉法測量菌落直徑，以平均值代表菌落大小。通過濃度對數(shù)值（X）和抑制率幾率值（Y）之間的線性回歸關(guān)系求出毒力回歸方程和EC50。

2種藥劑85%氨基寡糖素和97%咪鮮胺原藥進(jìn)行混配，有效成分配比為1∶1、1∶3、1∶5、3∶1、5∶1，每個配比配制成相應(yīng)5個濃度梯度。采用生長速率法對西瓜枯萎病菌進(jìn)行聯(lián)合毒力測定。計算混配劑對菌絲生長抑菌率，分別求得藥劑不同混配比例的毒力回歸方程、EC50和相關(guān)系數(shù)。并根據(jù)孫云沛公式計算共毒系數(shù)（CTC），確定不同比例混劑的相互作用。

1.5? 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)各處理7 d的平均菌落直徑凈增長值，分別計算每種藥劑各個濃度的實際抑制率，見式（1）。建立以濃度的自然對數(shù)值為自變量（X），抑菌率的幾率值為因變量（Y）的回歸方程（毒力回歸方程見式（2），a為回歸截距，b為回歸系數(shù)），用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算各藥劑的EC50[4]。將抑制率換算成幾率值（縱坐標(biāo)）濃度換成10為底對數(shù)（橫坐標(biāo)），根據(jù)最小二乘法求出EC50。根據(jù)孫云沛公式計算共毒系數(shù)CTC，見式（3）至式（6）[5]。

抑制率=×100%? （1）

Y=a+bX? （2）

毒力指數(shù)（TI）=×100? ?（3）

實際毒力指數(shù)（ATI）=×100 （4）

混配理論毒力指數(shù)（TTI）=T1×[A/（A+B）]+T2×[（B/A）+B]? ?（5）

共毒系數(shù)（CTC）=（ATI/TTI）×100? ?（6）

式中，T1為標(biāo)準(zhǔn)藥劑毒力指數(shù);T2為供試藥劑毒力指數(shù);A/（A+B）為標(biāo)準(zhǔn)藥劑混配中所占的百分比;B/（A+B）為供試藥劑混配中所占的百分比。

以CTC評判兩種藥劑的聯(lián)合毒力作用。CTC<80為拮抗作用，80≤CTC≤120為相加作用，CTC>120為增效作用。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 病害癥狀及致病性測定

接種5 d后西瓜莖基部開始發(fā)病，變黃褐色，有輕微縊縮，并伴有開裂現(xiàn)象，后期葉片萎蔫直至枯死，有時造成幼苗猝倒。癥狀與田間觀察相同，對照沒有發(fā)病。將發(fā)病的病斑進(jìn)行組織分離，獲得的病原菌與原接種菌HNXG1601一致，根據(jù)柯赫氏法則證明接種菌即為致病菌。

2.2? 病原菌鑒定

培養(yǎng)性狀：25 ℃黑暗條件下在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，菌絲輻射狀向外生長，氣生菌絲氈狀，絨狀，菌落白色至淺紅色（圖1a）。菌落生長前期培養(yǎng)基為白色，后期培養(yǎng)基不變色或變淺紅褐色（圖1b）。

顯微特征：病原菌菌絲無色，多分枝，具隔膜;產(chǎn)孢細(xì)胞為單瓶梗，結(jié)構(gòu)簡單，產(chǎn)孢梗短，直立，無色，不具隔膜;典型的小型分生孢子數(shù)量多，小型分生孢子假頭狀著生，卵圓形至橢圓形，大?。?.3～13.8 μm×2.5～4.0 μm;大型分生孢子有或無，鐮刀形或梭形，向兩端漸尖，足細(xì)胞明顯，多為2～4個隔膜，大小為18.6～37.8 μm×2.5～4.5 μm（圖1c）;厚垣孢子多頂生，單生或串生，黃褐色，球形或近球形。

對病原菌進(jìn)行擴(kuò)增，片段大小為545 bp。測序結(jié)果與NCBI基因序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)菌株HNXG1601與登錄號為KC201696.1的菌株同源性達(dá)100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)進(jìn)一步鑒定該病原菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schlecht）。

2.3? 藥劑聯(lián)合毒力測定

由表2可知，85%氨基寡糖素∶97%咪鮮胺=1∶1、1∶3和1∶5時共毒系數(shù)分別為33.68、56.97、73.34，小于80，屬于拮抗作用;85%氨基寡糖素∶97%咪鮮胺=3∶1和5∶1時共毒系數(shù)分別為167.88和149.67，大于120，具有增效作用，且混配比為3∶1時增效最高，具有明顯增效作用。

3? 小結(jié)與討論

尖孢鐮刀菌是一種嚴(yán)重危害寄主的土壤習(xí)居菌，能夠侵染葫蘆科、茄科、十字花科、豆科、花卉、水果等多種作物，導(dǎo)致枯萎病的發(fā)生[6]。枯萎病在作物的全生育期內(nèi)均可發(fā)生[7]，其癥狀常表現(xiàn)為植株萎蔫、葉片早落、維管束系統(tǒng)褐變、堵塞，最終使植株死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。本研究通過形態(tài)學(xué)及ITS測序，鑒定出引起海南陵水潤達(dá)設(shè)施西瓜基地西瓜萎蔫死苗的病原菌為尖孢鐮刀菌。目前，針對由尖孢鐮刀菌引起的枯萎病防控仍以化學(xué)藥劑防治為主，本研究通過前人對枯萎病的防治研究[9，10]，篩選兩類作用機理不同的殺菌劑（免疫誘抗劑和咪唑類殺菌劑）進(jìn)行混配增效試驗，發(fā)現(xiàn)85%氨基寡糖素和97%咪鮮胺混配比例為3∶1時，增效作用最好，共毒系數(shù)為167.88，對西瓜枯萎病菌菌絲具有很好的抑制效果。

氨基寡糖素本身對病原菌的抑制作用較弱，主要是通過誘導(dǎo)植物體提高自身對外界的免疫力，從而達(dá)到抗病效果，促進(jìn)作物健康生長，是一類新型多功能植物免疫誘抗劑。咪鮮胺是一種高效、廣譜、低毒的甾醇脫甲基化抑制劑，其作用方式獨特，可通過與細(xì)胞色素P450甾醇生物合成的必需酶14α-脫甲基酶（CYP51）的血紅素鐵相互作用而抑制真菌的生長，目前田間尚未檢測到對咪鮮胺產(chǎn)生抗性的尖孢鐮刀菌菌株[11]，并且國外早有使用咪鮮胺防治由尖孢鐮刀菌引起的枯萎病的報道，并具有較好的防治效果[12]，但在中國尚未大面積應(yīng)用推廣。

本試驗室內(nèi)藥劑毒力測定結(jié)果表明，85%氨基寡糖素∶97%咪鮮胺=3∶1對西瓜枯萎病菌菌絲具有很好的抑制效果，為西瓜生產(chǎn)上防治枯萎病提供了理論依據(jù)。

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