楊晉明，王 銘，杜建中

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原 030031）

甜瓜（Cucumis melo L.）在我國有著悠久的栽培歷史，因香甜可口和降暑的作用而受到人們的喜愛，尤其是高度進(jìn)化的網(wǎng)紋甜瓜更是以高檔水果的身份進(jìn)入現(xiàn)代消費(fèi)社會(huì)，作為四季常鮮的水果，受到各界人士的青睞，售價(jià)居高不下，產(chǎn)品暢銷國內(nèi)外。我國長江以南地區(qū)利用大棚秋季栽培網(wǎng)紋甜瓜，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。然而在生產(chǎn)上，甜瓜的栽培管理會(huì)受到各種病害的嚴(yán)重制約，如枯萎病、白粉病、蔓枯病等真菌性病害，正常年份可造成甜瓜10%～15%的產(chǎn)量損失，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)損失可高達(dá)30%[1]。常規(guī)育種技術(shù)雖然使新培育的甜瓜品種抗性有所提高，但由于受到資源限制，仍無法滿足生產(chǎn)上的需求。生物技術(shù)的誕生為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)開辟了一條嶄新的育種途徑，科學(xué)家采用基因工程技術(shù)將一些能夠提升植物抗病性的基因?qū)胫仓?，獲得了一些抗病性植株。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用在甜瓜性狀改良和育種上，起步于上世紀(jì)末。國外，1990年美國Michigan 州立大學(xué)的Fang 和Grumet[2]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗卡那霉素基因（NPTⅡ）導(dǎo)入甜瓜，開啟了轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)制和培育甜瓜新品種的新紀(jì)元；1993年，Yoshikawa等[3]將黃瓜花葉病毒外殼蛋白基因（CMV-CP）導(dǎo)入甜瓜；1997年，F(xiàn)uchs等[4]將得到的抗小西葫蘆黃花葉病毒、抗黃瓜花葉病毒和抗西瓜花葉病毒2號(hào)的甜瓜品系，在大田做生物學(xué)鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因個(gè)體的病毒侵染率在8%～33%，而對(duì)照的病毒感染率高達(dá)99%；與非轉(zhuǎn)化體相比，轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)量提高了62%左右，甜瓜的商品率增加60%。國內(nèi)，甜瓜轉(zhuǎn)基因研究開始稍晚一些，1994年，孫嚴(yán)等[5]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CMV外殼蛋白cDNA基因?qū)胩鸸?，獲得了抗CMV的甜瓜植株；2001年，鐘俐等[6]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將雪花蓮凝集素（GNA）基因?qū)胩鸸掀贩N皇后和伽師瓜，飼蚜試驗(yàn)結(jié)果證明，轉(zhuǎn)化植株獲得了棉蚜抗性；2006年，黃永紅[7]用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將甜瓜ACC氧化酶導(dǎo)入甜瓜品種‘gt-1’，使得轉(zhuǎn)化植株果實(shí)的耐貯藏性提高；2014年，郝金鳳等[8]以河套甜瓜原種為試驗(yàn)材料，以甜瓜腋芽生長點(diǎn)作為外植體，根據(jù)農(nóng)桿菌菌液濃度和處理時(shí)間的不同配置，建立和優(yōu)化了甜瓜生長點(diǎn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化體系，獲得了陽性植株。

關(guān)于幾丁質(zhì)酶基因?qū)胩鸸系难芯?，目前國?nèi)外，僅見2003年葛屹松[9]等人的報(bào)道，該課題組將抗真菌蛋白幾丁質(zhì)酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因?qū)牖屎蟆⒓t蜜脆等甜瓜品種，經(jīng)分子檢測證明獲得了轉(zhuǎn)化植株，目的基因在轉(zhuǎn)化植株中得到了表達(dá)。

甜瓜導(dǎo)入幾丁質(zhì)酶基因可以預(yù)防某些甜瓜的真菌病原菌的危害，其作用機(jī)制：轉(zhuǎn)化幾丁質(zhì)酶基因的植株所表達(dá)的幾丁質(zhì)酶能夠降解真菌細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì)，從而使真菌裂解和無法正常繁殖，達(dá)到防治真菌侵害和危害的目的。

鑒于此前有關(guān)幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化甜瓜的文獻(xiàn)較少，而且這些文獻(xiàn)也僅僅是報(bào)道得到轉(zhuǎn)化植株，對(duì)轉(zhuǎn)化幾丁質(zhì)酶基因的植株的真菌病抗性仍缺少進(jìn)一步的研究，因此針對(duì)幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化甜瓜的研究是很有必要的。

本文擬以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將水稻幾丁質(zhì)酶基因?qū)胩鸸掀贩N，在獲得轉(zhuǎn)化植株的基礎(chǔ)上，探討幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化個(gè)體（株系）對(duì)真菌病——白粉病的抗性變化。

1 材料和方法

1.1 植物材料和質(zhì)粒

以本課題組保存的甜瓜品種雪脆蜜2號(hào)作為轉(zhuǎn)化對(duì)象，進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)化植株對(duì)白粉病的抗性變化。

轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒為pGI 11一RC-1（圖1）由本中心基因工程研究室友情提供。其攜帶有水稻幾丁質(zhì)酶基因和潮霉素抗性基因，農(nóng)桿菌菌株為LBA4404。

圖1 質(zhì)粒pGL II-RC-1結(jié)構(gòu)圖

1.2 轉(zhuǎn)化方法

1.2.1 農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)

挑取含有質(zhì)粒pGI 11一RC-1的農(nóng)桿菌單菌落，接種于YEP液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48h。取出菌液用YEP液體培養(yǎng)基稀釋至OD600值為0.2～0.4，4℃冰箱臨時(shí)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 外植體制備、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化

種子消毒、外植體制備、再生體系的建立及外植體轉(zhuǎn)化方法參見葛屹松[9]文獻(xiàn)。

1.3 分子檢測

1.3.1 取樣和DNA提取

所有再生植株全部取樣，即摘取其幼嫩葉片500mg左右，采用CTAB法[10]提取植物DNA，同時(shí)按堿裂解法[11]提取質(zhì)粒DNA。

1.3.2 PCR檢測

以非轉(zhuǎn)化植株的樣品為陰性對(duì)照，質(zhì)粒DNA為陽性對(duì)照。樣品的PCR擴(kuò)增引物、擴(kuò)增體系配制和擴(kuò)增條件參見杜建中[12]文獻(xiàn)。

1.3.3 Southern blot雜交分析

取PCR檢測結(jié)果為陽性的植株的DNA進(jìn)行Southern blot檢測，所用試劑盒是Roche公司生產(chǎn)的DIG DNA Labling and Detection Kit。對(duì)PCR檢測結(jié)果為陽性的植株DNA全部進(jìn)行Southern blot雜交分析。待檢樣品DNA、陰性對(duì)照DNA、質(zhì)粒DNA均用Hind Ⅲ 酶切，酶切反應(yīng)體系總體積25μL，其中10×buffer 2.5μL，DNA溶液10μL，限制性內(nèi)切酶5μL，加水7.5μL。反應(yīng)管5000 r/min離心15 s，然后37℃水浴中酶切過夜。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離4h。隨后的DNA處理方法參見《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[13]。雜交用探針按試劑盒說明書制備，用CSPD（Roche）熒光染色雜交條帶，并 X-光片自顯影曝光。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照。

1.4 轉(zhuǎn)化植株抗病性的生物學(xué)鑒定

1.4.1 采集病原菌、制備分生孢子懸浮液

從田間采集感病的甜瓜葉片，冷凍保存。參見鄧麗君等[14]方法制備病原菌分生孢子懸浮液備用。

1.4.2 田間接種病原菌

移栽轉(zhuǎn)基因甜瓜植株和非轉(zhuǎn)化植株至溫室，每個(gè)處理各9株，3次重復(fù)。5葉期采用鄧麗君等[14]的孢子懸浮液噴霧接種法進(jìn)行田間接種，接種一周后開始田間調(diào)查記錄，3周時(shí)調(diào)查發(fā)病情況。病情指數(shù)（DI）計(jì)算公式如下，參見鄧麗君等[14]文獻(xiàn)。

分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按照《中國蔬菜病蟲預(yù)測預(yù)報(bào)》的方法[15]?；铙w植株接種病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和白粉病抗感分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參見鄧麗君等[14]文獻(xiàn)。

2 結(jié)果分析

2.1 再生轉(zhuǎn)化苗的獲得

通過培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化，共獲得再生轉(zhuǎn)化苗213株，其中有11株根系不發(fā)達(dá)，苗勢較弱，淘汰。其余202株全部取樣進(jìn)行PCR檢測。

2.2 分子檢測結(jié)果

2.2.1 PCR檢測

202個(gè)待測樣品中，經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測，發(fā)現(xiàn)有17株材料的樣品中有目的基因的存在，認(rèn)定為疑似轉(zhuǎn)化植株。圖2為部分材料的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果。由圖中可以看出，陰性對(duì)照無特異擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，證明擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件是正確的，1～8號(hào)轉(zhuǎn)基因植株的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)與陽性對(duì)照大小一致的特異擴(kuò)增條帶（376bp），證實(shí)這些轉(zhuǎn)基因植株的DNA中包含有目的基因幾丁質(zhì)酶基因的序列。

圖2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測結(jié)果

2.2.2 Southern blot雜交分析

17株認(rèn)定的疑似轉(zhuǎn)化植株，經(jīng)Southern blot雜交分析，發(fā)現(xiàn)11個(gè)植株的DNA中，雜交出與陽性對(duì)照DNA同樣大小的特異雜交條帶，證明轉(zhuǎn)基因植株中目的基因業(yè)已整合到甜瓜的基因組上，確為轉(zhuǎn)基因植株。11個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的雜交分析中，有1株出現(xiàn)3條雜交條帶，另一株出現(xiàn)2條雜交條帶，剩余9株均只出現(xiàn)一條雜交帶，選取這9株進(jìn)行快繁，以便有足夠的移栽苗進(jìn)行田間播種進(jìn)一步做抗病生物學(xué)鑒定。圖3為這9個(gè)轉(zhuǎn)基因植株DNA的Southern blou雜交結(jié)果，可以看出，除了陰性對(duì)照沒有任何雜交條帶外，陽性對(duì)照和9個(gè)轉(zhuǎn)基因植株均顯現(xiàn)出特異的雜交條帶。

圖3 轉(zhuǎn)基因材料的Southern blot雜交結(jié)果

2.3 抗病生物學(xué)鑒定

9個(gè)轉(zhuǎn)化植株（或后代）接種病原菌后，通過調(diào)查、計(jì)算和分析，其抗病性鑒定結(jié)果見表1。

由表1可以看出，陰性對(duì)照發(fā)病率100%，證明白粉病菌的田間接種成功。轉(zhuǎn)基因材料，除T9外，其余8個(gè)轉(zhuǎn)化植株的植株均達(dá)到抗病標(biāo)準(zhǔn)，其中T3達(dá)到高抗病水平，其它為中抗或抗病。但各植株的白粉病抗性之間仍存在差異，這可能與目的基因在各個(gè)體中的表達(dá)與否或表達(dá)水平有關(guān)，有關(guān)這個(gè)問題以及目的基因在轉(zhuǎn)化植株中的遺傳、表達(dá)規(guī)律和抗性仍需進(jìn)一步研究。

表1 轉(zhuǎn)基因甜瓜植株田間接種白粉病菌的抗病鑒定結(jié)果

本研究證明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甜瓜的轉(zhuǎn)化率在4%～5%之間，通過轉(zhuǎn)化可獲得轉(zhuǎn)水稻幾丁質(zhì)酶基因的甜瓜植株，幾丁質(zhì)酶基因的導(dǎo)入賦予這些轉(zhuǎn)基因植株白粉病抗性，一般可提高2～4個(gè)抗性級(jí)別。因此通過篩選能夠培育出高抗白粉病的轉(zhuǎn)基因甜瓜品種。

3 討論

感染白粉病的甜瓜生長緩慢，使得甜瓜無法完成由營養(yǎng)生長到生殖生長的過度，從而影響甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)[16]。常規(guī)的白粉病藥物防治既費(fèi)工、費(fèi)錢，又或多或少在果實(shí)上產(chǎn)生藥物殘留，不利于食用者的身體健康。采用常規(guī)育種與轉(zhuǎn)基因技術(shù)、分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)有機(jī)結(jié)合的方法，可以創(chuàng)制和培育出高抗白粉病的甜瓜品種。鞠立君[17]將甜瓜CmLOX09基因?qū)敕?，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄植株抗白粉病能力增強(qiáng)，并推測CmLOX09通過AOS途徑產(chǎn)生的JA相應(yīng)白粉病的侵染。王磊[18]將葡萄泛素連接酶基因VERH2導(dǎo)入歐洲葡萄無核白和擬南芥中，轉(zhuǎn)基因葡萄和擬南芥對(duì)白粉病的抗性均有所提高。王亞軍[19]報(bào)道，小麥導(dǎo)入TaRGA抗病基因，增強(qiáng)了小麥的白粉病抗性。這些報(bào)道均證明導(dǎo)入植物體某種抗病基因，可以提高該轉(zhuǎn)基因植株白粉病的抗性。

幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)產(chǎn)物通過降解真菌細(xì)胞壁的組成物質(zhì)幾丁質(zhì)而賦予轉(zhuǎn)基因植株對(duì)真菌病的抗性。幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化研究在玉米[12]、小麥[20]、葡萄[21]、黑麥草[22]等植物上都獲得成功，外源基因的表達(dá)使得轉(zhuǎn)化植株提高了對(duì)白粉病的抗性，這些均與本研究的結(jié)論相近，說明幾丁質(zhì)酶基因的導(dǎo)入可以提高植物對(duì)白粉病的抗性。此外就轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題，1999年，Yutaka[23]報(bào)道，導(dǎo)入CMV基因片段的轉(zhuǎn)基因甜瓜，與非轉(zhuǎn)化甜瓜比較，果實(shí)的形態(tài)，花粉的結(jié)構(gòu)、壽命、萌發(fā)與傳播大致相同，對(duì)田間雜草、土壤微生物群落等的影響也基本一致，證明轉(zhuǎn)基因甜瓜對(duì)種植環(huán)境無危害；應(yīng)奇才等[24]設(shè)計(jì)了轉(zhuǎn)WMV-2CP基因的甜瓜喂飼小鼠的試驗(yàn)，急性毒性、亞急性毒性和致突變?cè)囼?yàn)證明轉(zhuǎn)基因甜瓜不含有急性毒性物質(zhì)；微核試驗(yàn)和精子畸變?cè)囼?yàn)的結(jié)果也證實(shí)沒有發(fā)生基因突變；喂飼轉(zhuǎn)基因甜瓜的小鼠的各項(xiàng)生理特征與對(duì)照組并無明顯差異。這些均表明轉(zhuǎn)基因甜瓜的食用和環(huán)境釋放是安全的。