譚紅巖　陳利英　趙茹霞　周國娜

摘 要：針對不同林分類型（油松純林和油松-山杏混交林）和不同刺激（取食和剪葉）下油松針葉蛋白質(zhì)含量的變化進行研究，結(jié)果表明：混交林相比于油松純林，油松針葉蛋白質(zhì)含量高;10頭油松毛蟲處理的油松針葉比對照的蛋白質(zhì)含量高;30頭油松毛蟲處理的油松針葉比對照的蛋白質(zhì)含量低;而剪葉刺激下的油松針葉與對照的蛋白質(zhì)含量差異不明顯。該研究揭示了不同條件對油松針葉蛋白質(zhì)含量的影響，為進一步探討油松的防御機制和對油松毛蟲的生態(tài)防治、有效調(diào)控提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：林分類型;取食;剪葉;油松;蛋白質(zhì);含量

中圖分類號 S79文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）15-0020-04

Changes of Protein Content in Pinus tabuliformis Needles under Different Stimulation Methods

Tan Hongyan1 et al.

（1Pingquan Huangtuliangzi Forestry Adiministration，Pingquan 067500，China）

Abstract：In this paper，the changes in protein content of Pinus tabuliformis needles under different forest types（pure forest of Pinus tabuliformis and Pinus tabuliformis and apricot mixed forest） and different stimulates（feeding and cutting leaves） were studied.The results show that the protein content of Pinus tabuliformis needles in mixed forest was higher than that in pure forest;the protein content of Pinus tabuliformis needles treated with 10 Dendrolimus tabulaeformis was higher than that of contrast;the protein content of Pinus tabuliformis needles treated with 30 Dendrolimus tabulaeformis was lower than that of contrast;however，the protein content of Pinus tabuliformis needles stimulated by leaf cutting was not significantly different from that of contrast.The effects of different conditions on the protein content in Pinus tabuliformis needles were revealed.It provides theoretical basis for further discussion on the defense mechanism of Pinus tabuliformis and ecological control and effective regulation of Dendrolimus tabulaeformis.

Key words：Forest type;Feeding;Leaf cutting;Pinus tabuliformis;Protein;Content

油松是我國特有的樹種之一，也是我國北方干旱地區(qū)的主要造林樹種，生于海拔100～2600m地帶，多為純林。油松根系發(fā)達，耐干旱、耐寒冷，具有很強的保持水土和涵養(yǎng)水源的能力[1]，其不僅具有重要的生態(tài)價值，還有著重要的工業(yè)價值和觀賞價值。

油松毛蟲屬鱗翅目枯葉蛾科松毛蟲屬，發(fā)生量大、為害嚴重，輕則使針葉枯萎、發(fā)黃，重則導(dǎo)致油松整株或成片死亡[2-3]，對河北省的油松林造成了極大的影響。為了更好地對油松毛蟲進行生態(tài)防治，有必要研究油松毛蟲誘導(dǎo)油松的抗性機制。研究發(fā)現(xiàn)，植物在面對化學(xué)刺激、機械損傷、昆蟲取食、逆境脅迫等不利的生存環(huán)境時，為了自我保護，會刺激其自身防御機制的形成。一般來說，誘導(dǎo)防御的過程有以下3個階段：系統(tǒng)監(jiān)測、信號識別、防御物質(zhì)的產(chǎn)生[4]。對于防御物質(zhì)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在被油松毛蟲取食后，油松體內(nèi)各種營養(yǎng)物質(zhì)均發(fā)生了一定的變化，說明營養(yǎng)物質(zhì)也可能參與了防御過程[5-6]。植物對昆蟲產(chǎn)生防御機制時，最主要的物質(zhì)是化學(xué)物質(zhì)，如某些次生代謝物、抗性相關(guān)蛋白質(zhì)酶、蛋白質(zhì)酶抑制劑等[7-8]。取食和剪葉刺激也可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)酶抑制劑的變化[9]?？偟膩碚f，植物激活自身的防御系統(tǒng)主要是通過形成與抗性相關(guān)的物質(zhì)，進而進行防御[10-11]。

本研究通過比較不同林分類型和不同刺激方式下油松針葉內(nèi)蛋白質(zhì)含量的差異，為進一步了解油松在不同條件下的抗性機制以及油松和油松毛蟲之間的相互作用提供理論基礎(chǔ)，對油松毛蟲的生態(tài)防治、有效調(diào)控具有一定的實踐指導(dǎo)意義。

1 試驗地概況

試驗地為油松毛蟲的多發(fā)區(qū)，位于承德市平泉縣黃土梁子鎮(zhèn)的油松林區(qū)。海拔550～950m，屬于燕山山脈的東北方向山地的中心地帶，是河北省油松適生區(qū)的代表地段。

2 材料與方法

2.1 材料采集 分別在油松-山杏混交林和油松純林2種類型的林地內(nèi)設(shè)置一個50m×50m的標準樣地，在標準樣地內(nèi)選擇無松毛蟲取食、樹齡為25a生的油松各20株（注意：每株樹的各項條件都保持一致）。分別設(shè)置4個處理：對照、10頭油松毛蟲取食（簡稱：10頭處理，下同）、30頭油松毛蟲取食（簡稱：30頭處理，下同）、剪葉處理（注意：要保證每天剪掉的量與30頭油松毛蟲每天的取食量相同）。每處理設(shè)置5次重復(fù)，選擇4～7齡的油松毛蟲進行實驗，采用野外套籠放養(yǎng)的方法，注意定期更換套籠枝條，經(jīng)過為期60d的實驗后結(jié)束處理。分別在各種處理的每株油松大致相同位置的樹冠中剪取未被油松毛蟲取食過的2a生新鮮的油松針葉，迅速放入液氮中暫時保存，將其帶回實驗室后放入-80℃超低溫冰箱中保存。

2.2 試驗方法

2.2.1 儀器設(shè)備 分析天平、稱量紙、研缽、藥匙、水浴鍋、移液槍、無菌槍頭、10mL離心管、離心機、300mL錐形瓶、燒杯、HY-5A回旋式振蕩器（金壇市杰瑞爾電器有限公司）、Eppendorf5430R小型臺式高速冷凍離心機、冰袋、試管架。

2.2.2 主要試劑及用量 詳見表1。

2.2.3 蛋白質(zhì)提取 （1）每組樣品各1g，放于事先預(yù)冷的研缽中研磨，為方便研磨，研磨過程中可加入液氮。將樣品研磨成粉末，然后每個研缽中加入3mL預(yù)冷的蛋白質(zhì)提取緩沖液，繼續(xù)研磨至勻漿狀。（2）將研磨好的勻漿轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，渦旋30s后，于4℃下靜置4h。（3）在離心管中加入等體積的Tris-飽和酚（pH7.5），混合物渦旋30s，于-20℃靜置1h。（4）取出并于4℃下10000r/min離心30min，然后用移液器吸取上層酚層，導(dǎo)入10mL離心管中（導(dǎo)入之前稱管重），剩余的水相用4mL提取液和4mL Tris-飽和酚（PH7.5）再次提取。（5）離心后再次吸取酚層導(dǎo)入之前的離心管中，將2次提取的酚層合并混勻，再加入5倍體積預(yù)冷的0.1M乙酸銨/甲醇使蛋白質(zhì)沉淀，渦旋后置于-20℃過夜。（6）次日早晨取出混合物，在4℃下10000r/min離心30min，將沉淀取出，用預(yù)冷的0.1M乙酸銨/甲醇、甲醇、丙酮、80%丙酮依次清洗后真空干燥。（7）稱重，減去之前的空管重，計算所提取蛋白質(zhì)的含量。

2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析 用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)計算及繪制圖表，用DPS軟件，LSD法進行多重比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同處理對油松針葉蛋白質(zhì)含量的影響 由表2可以看出：混交林的不同處理之間，蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)為：10頭處理>對照>剪葉處理>30頭處理;與對照相比，10頭處理的油松針葉內(nèi)蛋白質(zhì)含量較多，30頭處理的油松針葉內(nèi)蛋白質(zhì)含量較少，剪葉處理則無明顯差別;經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)（F=230.38，P=0.0001），各種處理方式均可對油松針葉蛋白質(zhì)含量產(chǎn)生影響，且達到顯著水平，但各處理影響的程度存在差異。不同處理方式之間，昆蟲取食對油松針葉蛋白質(zhì)含量的影響程度更明顯，而剪葉刺激對油松針葉蛋白質(zhì)含量的影響程度則不明顯。10頭處理比30頭處理的油松針葉蛋白質(zhì)含量明顯增多，且達到極顯著。純林的不同處理之間表現(xiàn)出與混交林相同的規(guī)律。

以上數(shù)據(jù)表明：昆蟲取食和剪葉刺激均可誘導(dǎo)油松防御機制的產(chǎn)生，并刺激相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，但昆蟲取食誘導(dǎo)油松產(chǎn)生防御機制的程度更明顯，且隨著取食程度的增加，相關(guān)蛋白質(zhì)的含量減少?？赡苁且驗橛退擅x的取食刺激是物理機械損傷以及昆蟲口腔分泌物的化學(xué)刺激的雙重誘導(dǎo)，而剪葉處理主要是單純的機械損傷，前者所造成的影響更加繁瑣而復(fù)雜[12]。當外界刺激到達一定程度時，才能刺激油松體內(nèi)的防御機制，產(chǎn)生防御蛋白質(zhì)。但當刺激超出了某一范圍時，比如油松毛蟲數(shù)量過多，會摧毀油松的防御機制，導(dǎo)致油松針葉內(nèi)蛋白質(zhì)減少[13-14]。

3.2 不同林分類型對油松針葉蛋白質(zhì)含量的影響 通過了解2種不同林分類型的油松針葉蛋白質(zhì)含量的變化，進一步分析林分類型對油松針葉蛋白質(zhì)含量變化的影響。

3.2.1 自然條件下（對照處理）不同林分類型油松針葉蛋白質(zhì)含量的變化 從圖1可以看出：混交林的油松針葉蛋白質(zhì)含量比純林的高（混交林為0.017，純林為0.0154）;從顯著性水平來看（F=73.52，P=0.001），混交林和純林自然狀態(tài)下的油松針葉蛋白質(zhì)含量差異性極其顯著。說明自然條件下，不同林分類型的油松針葉蛋白質(zhì)含量不同，且混交林大于純林。而造成這種現(xiàn)象的原因可能與不同林分類型下陽光、水分、熱量、養(yǎng)分、生物多樣性等方面存在的差異有關(guān)。另外，有關(guān)學(xué)者發(fā)現(xiàn)同一種植物在不同的林分類型下，植物體內(nèi)的生化物質(zhì)發(fā)生變化，使蛋白質(zhì)含量發(fā)生變化[15]。

3.2.2 10頭取食處理油松針葉蛋白質(zhì)含量的變化 從圖2可以看出：混交林10頭取食的油松針葉蛋白質(zhì)含量比純林的高（混交林為0.0206，純林為0.0185）;從顯著性水平來看（F=48.65，P=0.0022），兩者之間的差異達到極顯著水平。說明10頭油松毛蟲取食刺激下，不同林分類型的油松表現(xiàn)的反應(yīng)不同，且混交林的油松明顯高于純林。可能是因為混交林中群落結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，物種間競爭激烈，為適應(yīng)這種較為復(fù)雜的環(huán)境，植物的防御能力比純林中植物的防御能力較強，導(dǎo)致防御蛋白質(zhì)過量表達。

3.2.3 30頭取食處理油松針葉蛋白質(zhì)含量的變化 從圖3可以看出：混交林30頭取食的油松針葉蛋白質(zhì)含量比純林的高（混交林為0.0144，純林為0.0133）;從顯著性水平來看（F=54.45，P=0.0018），兩者之間的差異達到極顯著水平。說明經(jīng)過30頭取食的不同林分類型的油松針葉蛋白質(zhì)含量存在明顯差異，變化規(guī)律與10頭相一致。可見，在一定油松毛蟲取食為害下，混交林與純林相比，表現(xiàn)出較高的防御能力。

3.2.4 剪葉處理油松針葉蛋白質(zhì)含量的變化 由圖4可以看出：混交林剪葉處理的油松針葉蛋白質(zhì)含量比純林處理的稍高（混交林為0.0161，純林為0.0159），但從顯著性水平分析來看（F=7.00，P=0.0572），兩者之間的差異并未達到顯著性水平。說明剪葉刺激下能引起不同林分類型的油松針葉蛋白質(zhì)含量的差異，但差異不顯著。研究表明，植物抗性不僅表現(xiàn)在植物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)和某些次生物質(zhì)的差異上，還表現(xiàn)在植物體內(nèi)防御蛋白質(zhì)的變化上。而剪葉處理可能只影響植物體內(nèi)某些特定的物質(zhì)變化，而對防御蛋白質(zhì)方面的影響較小，另外也說明不同的刺激方式下可能誘導(dǎo)的植物體內(nèi)的抗性機制存在一定的差異。

4 結(jié)論與討論

4.1 討論 （1）本實驗研究發(fā)現(xiàn)，油松毛蟲取食對油松針葉蛋白質(zhì)含量存在一定的影響，且10頭取食比對照蛋白質(zhì)含量高，30頭取食比對照油松針葉蛋白質(zhì)含量低，說明油松毛蟲數(shù)量超過一定限度時，會使體內(nèi)蛋白質(zhì)含量減少。也有研究發(fā)現(xiàn)，油松體內(nèi)蛋白質(zhì)含量與油松的樹齡存在一定的關(guān)系。至于蛋白含量與油松抗性的關(guān)系，還有待于進一步研究。（2）研究表明，植物的抗性隨著環(huán)境條件和植物體內(nèi)營養(yǎng)成分而變化，使昆蟲的生長發(fā)育和繁殖受到影響[15-16]，植物體內(nèi)防御蛋白也隨著油松毛蟲數(shù)量而發(fā)生變化。植物體內(nèi)營養(yǎng)成分以及防御蛋白的變化與昆蟲生長繁殖之間的關(guān)系，還有待今后作進一步研究。也有研究表明，油松和油松毛蟲之間的防御和反防御交替進行。對油松和油松毛蟲之間的相互作用進行研究，可以為油松毛蟲的生態(tài)防治提供理論依據(jù)。

4.2 結(jié)論 （1）昆蟲取食和剪葉刺激均可誘導(dǎo)油松防御機制的產(chǎn)生，并刺激相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，但昆蟲取食誘導(dǎo)油松合成相關(guān)蛋白質(zhì)的程度更明顯。（2）取食程度影響誘導(dǎo)油松產(chǎn)生抗性的程度，在一定的程度內(nèi)，隨著油松毛蟲取食程度的增加，油松針葉內(nèi)相關(guān)蛋白質(zhì)的含量減少。（3）不同林分類型下油松的抗性機制不同，油松針葉內(nèi)蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)為混交林高于純林。

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（責(zé)編：張宏民）