鄭賽巍， 周楊一帆， 蔡麗婷， 李玉婷， 何 園

(1. 同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院和同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔黏膜病教研室，上海牙修復(fù)與再生工程實(shí)驗中心，上海 200072; 2. 同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院和同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科教研室，上海牙修復(fù)與再生工程實(shí)驗中心，上海 200072; 3. 同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物信息學(xué)科，上海 200092)

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus, OLP)是發(fā)生于口腔黏膜的慢性炎癥性疾病，是口腔黏膜三大常見病之一。該病往往慢性遷延，反復(fù)發(fā)生糜爛、疼痛，很難徹底根治，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，部分病損可發(fā)展為口腔鱗癌，其病因及發(fā)病機(jī)制不明[1]。隨著微生物組學(xué)研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明，與人體密切接觸的口腔共生菌可能是促進(jìn)機(jī)體發(fā)生局部免疫失衡的重要因素[2]，共生菌是指與人體生物體共同生存的細(xì)菌，共生菌群組成的改變，即有益菌與致病菌的平衡失調(diào)，與多種局部與全身性疾病的發(fā)生發(fā)展密切有關(guān)[3]，但目前尚未見到口腔共生菌與OLP發(fā)病相關(guān)性的研究。因此，本研究旨在探索口腔共生菌產(chǎn)黑普氏菌在OLP的發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2015年—2017年于同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院就診的口腔扁平苔蘚患者共43例，非糜爛型與糜爛型，所有患者均經(jīng)臨床檢查及活檢證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn): (1) 患有全身系統(tǒng)性疾病及腫瘤；(2) 涎腺疾??；(3) 近6個月使用皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑等藥物治療；近1個月使用抗生素；(4) 女性處于月經(jīng)期、妊娠期或哺乳期；(5) 藥物或銀汞合金充填物可能引起苔蘚樣反應(yīng)者；(6) 患有除口腔扁平苔蘚外其他黏膜病；(7) 吸煙。正常對照組48例為拔牙或外科小手術(shù)患者，年齡、性別與實(shí)驗組相匹配。所有OLP患者及對照組均簽署知情同意書，本項目實(shí)驗計劃得到同濟(jì)大學(xué)科學(xué)與倫理委員會審核與批準(zhǔn)。

1.2 樣本收集

OLP頰黏膜病損表面菌群樣本: 用無菌黏膜拭子，擦拭OLP病損部位表面10次，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

OLP病損組織樣本: 用1%碘酊棉球及乙醇棉球常規(guī)消毒后，切取OLP 5mm×5mm大小病損部位組織，迅速置于TRIzol A+試劑中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑

頰拭子DNA提取試劑盒Gentra Buccal Cell Kit購自美國凱杰生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成試劑盒，SuperReal熒光定量預(yù)混試劑(增強(qiáng)版)購自天根生化科技(北京)有限公司，氯仿、無水乙醇、DEPC水購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 頰拭子基因組DNA提取 取出頰黏膜拭子，用無菌剪剪斷頰拭子頭部，置于1.5mL離心管，根據(jù)試劑盒說明書，加300μL細(xì)胞裂解液，加1.5μL蛋白酶K，顛倒混勻25次后置于65℃水浴中至少1h，將棉拭子拿出，盡量去除頭部的液體，加1.5μL去RNA溶液，上下顛倒25次，37℃水浴15min，加100μL蛋白沉淀溶液，高速振蕩20s，冰浴5min，13000～16000 ×g離心3min。準(zhǔn)備一個新的1.5mL離心管，加入300μL異丙醇和0.5μL糖原溶液，離心后吸取上清液加入異丙醇當(dāng)中，輕柔翻轉(zhuǎn)50次，13000～16000 ×g離心5min，去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，13000～16000 ×g離心1min，加30μL DNA溶解液65℃水浴1h溶解DNA，蓋緊管蓋，室溫輕搖過夜，測DNA濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 頰拭子基因組16S rRNA擴(kuò)增 針對細(xì)菌16S rRNA V4可變區(qū)設(shè)計引物，引物序列見表1。為區(qū)分樣本，每個樣本設(shè)計其獨(dú)特的條碼序列，連接在正向引物上。最終測序產(chǎn)物為: 條碼序列+正向引物+barcode+目的序列+反向引物。PCR擴(kuò)增程序: 98℃，2min，1個循環(huán)；98℃，10s，55℃，20s，72℃ 30s 32循環(huán)；72℃ 5min；4℃結(jié)束。

1.4.3 高通量測序及生物信息學(xué)分析 測序平臺為Illumina Hiseq(PE250)，用Trimmomatic和QIIME(version 1.8)對序列進(jìn)行處理和分析，過濾序列測序質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于20，無法成對拼接以及序列長度低于200bp的序列。用UCLUST進(jìn)行OTU聚類，以相似度97%劃分操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)，Greengenes數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，用RDP分類器進(jìn)行物種分類注釋。運(yùn)用QIIME計算稀釋曲線和多樣性指數(shù)，并應(yīng)用Unweighted UniFrac方法計算樣本差異矩陣距離，然后進(jìn)行主成分分析(PCoA)。

1.4.4 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 按照氯仿法提取組織中總RNA，將組織剪碎加入預(yù)離心的PLG管，每1mL TRIzol A+加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置2～3min，4℃ 12000 ×g離心15min，將上層水相轉(zhuǎn)移至另一RNAse-free的離心管，加入等體積異丙醇，徹底混勻，室溫放置10min，4℃ 12000 ×g離心10min，棄上清液，75%乙醇清洗沉淀，4℃ 7500 ×g離心5min，DEPC水溶解RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)RNA，調(diào)整終濃度為25ng/μL。

1.4.5 qPCR方法 檢測OLP頰黏膜病損表面菌群中產(chǎn)黑普氏菌含量的qPCR反應(yīng)體系: 2×SuperReal 5μL，50×ROX 0.2μL，上下游引物各0.3μL基因組DNA(10ng/μL)2μL，dd H2O 2.2μL。反應(yīng)條件: 95℃ 5min 1個循環(huán)；95℃ 10s，60℃ 32s，40個循環(huán)。2-ΔΔCt法分析基因相對表達(dá)情況。

OLP病損組織中產(chǎn)黑普氏菌及細(xì)胞炎癥因子含量的qPCR反應(yīng)體系: 2×Super Real 10μL，50×ROX 2μL，上下游引物各0.6μL，cDNA 2μL，dd H2O 4.8μL。反應(yīng)條件: 95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 27s；共40個循環(huán)。并用2-ΔΔCt法分析基因相對表達(dá)情況，引物見表1。

表1 引物序列表

(續(xù)表1)

F為正義鏈，R為反義鏈；F/R為高通量測序引物，Pmg-F/R為產(chǎn)黑普氏菌基因組DNA qPCR引物，Pmc-F/R為產(chǎn)黑普氏菌cDNA qPCR引物

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般資料

采集OLP頰黏膜病損表面菌群樣本共43例，其中非糜爛型23例，糜爛型20例，正常對照組48例，兩組患者年齡、性別構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 研究對象基本信息

*檢驗方法為χ2檢驗，#檢驗方法為單因素方差分析

2.2 口腔扁平苔蘚頰黏膜病損表面菌群高通量測序及生物信息學(xué)分析結(jié)果

經(jīng)質(zhì)控后得3242615條測序數(shù)據(jù)，平均每個樣本測序條數(shù)為35600條，平均測序長度為428bp。樣品稀釋度如圖1A，可見隨著樣本測序條數(shù)增加，樣品稀釋度指數(shù)趨近于1，提示樣本測序深度足夠，結(jié)果可信。糜爛型、非糜爛型OLP頰黏膜菌群Shannon多樣性均高于對照組，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1B)，提示OLP頰黏膜表面菌群的種類更為豐富。主坐標(biāo)分析顯示糜爛型OLP與非糜爛型OLP頰黏膜表面菌群結(jié)構(gòu)均能與正常對照明顯分開，提示OLP頰黏膜表面菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著性改變(圖1C)；而糜爛型OLP組與非糜爛型OLP組交叉較多。本課題組通過宏基因組學(xué)與最新生物信息學(xué)方法成功將細(xì)菌的識別度延伸至種水平，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黑普氏菌在OLP頰黏膜表面構(gòu)成比顯著增加，且在門、科、屬、種各層次上的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1D)，提示該菌可能在OLP發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。

圖1 口腔扁平苔蘚頰黏膜病損表面菌群分析Fig.1 Bacterial flora analysis of OLP buccal mucosa lesion surfaceA: 樣品稀釋度曲線，接近于1，提示測序深度足夠，樣本可信；B: α多樣性，糜爛型和非糜爛型OLP的Shannon多樣性指數(shù)大于正常對照，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；C: 主坐標(biāo)分析顯示糜爛型OLP與非糜爛型OLP頰黏膜表面菌群均能與正常對照明顯分開，提示OLP頰黏膜表面菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著性改變；D: 基于不同分類單元的門、科、屬、種水平差異菌；*P<0.05；**P<0.01 ；***P<0.001；Control：正常對照；NEOLP：非糜爛型口腔扁平苔蘚；EOLP：糜爛型口腔扁平苔蘚

2.3 采用qPCR進(jìn)一步驗證高通量測序獲得的結(jié)果

進(jìn)一步采用qPCR檢測OLP頰黏膜病損表面菌群中產(chǎn)黑普氏菌的含量。OLP患者頰黏膜表面產(chǎn)黑普氏菌含量(NEOLP: 5.801，EOLP: 2.61)高于正常對照(1.051)，非糜爛型OLP(P=0.0001)和糜爛型OLP患者(P=0.00316)頰黏膜表面產(chǎn)黑普氏菌含量均高于正常對照，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與高通量測序所獲得的結(jié)果一致。

2.4 口腔扁平苔蘚病損組織中產(chǎn)黑普氏菌及細(xì)胞炎癥因子含量的變化

qPCR檢測OLP病損組織中產(chǎn)黑普氏菌以及細(xì)胞炎癥因子的含量變化，可見OLP病損組織中產(chǎn)黑普氏菌含量高于正常組織(P=0.0074)，同時IL-6含量也高于正常組織(P=0.0243)，且二者間有相關(guān)性，提示產(chǎn)黑普氏菌可能通過激活炎癥信號通路在OLP的致病過程中起到一定作用，見圖2。

圖2 口腔扁平苔蘚病損組織中產(chǎn)黑普氏菌 及細(xì)胞炎癥因子含量的變化Fig.2 Changes in the contents of Prevotellamelaninogenica and inflammatory cytokines in OLP lesionsA: qPCR檢測組織中產(chǎn)黑普氏菌及細(xì)胞因子含量；B: 產(chǎn)黑普氏菌與IL-6相關(guān)性；*P<0.05；**P<0.01

3 討 論

OLP是發(fā)生在口腔的慢性炎癥性疾病，全球發(fā)病率約為0.1%～2%，好發(fā)于中年女性，臨床表現(xiàn)分為糜爛型和非糜爛型，疼痛遷延不愈影響患者生活且部分可發(fā)展為口腔鱗癌，被WHO列為癌前狀態(tài)。目前國內(nèi)外學(xué)者公認(rèn)的觀點(diǎn)是免疫失調(diào)在OLP發(fā)病過程中起到重要的作用[1]。隨著微生物組學(xué)研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)，微生物和人體共同進(jìn)化，與全身健康與疾病的易感性密切相關(guān)，被譽(yù)為人體的“共生功能體”[4]。細(xì)菌是黏膜免疫反應(yīng)的關(guān)鍵驅(qū)動因素，可誘導(dǎo)上皮角質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)和功能的改變[5]。當(dāng)發(fā)生微生態(tài)失衡時，可導(dǎo)致T細(xì)胞活化而促發(fā)免疫功能失調(diào)，與多種局部和系統(tǒng)性疾病相關(guān)[2]。目前尚不清楚何種因素誘發(fā)了OLP的免疫失調(diào)，但越來越多的證據(jù)表明，與人體密切接觸的口腔共生菌可能是促進(jìn)該病理過程的重要因素。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)OLP頰黏膜表面微生物群落多樣性增加，其菌落結(jié)構(gòu)與正常相比發(fā)生顯著性改變[6]。多個來自不同研究者的研究支持本課題組的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)OLP病損黏膜表面及唾液中存在菌群結(jié)構(gòu)的改變[7-10]，且牙周致病菌在菌群中的構(gòu)成比升高[9]，提示牙周致病菌在OLP發(fā)病過程中起到直接或間接的作用[10]。

隨著近年來測序技術(shù)的長足進(jìn)步，本課題進(jìn)一步通過Illumina Miseq高通量測序，擴(kuò)大樣本量，加深測序深度(平均35600每次測序的讀長/樣本)，進(jìn)一步驗證了前期研究結(jié)果，并采用最新生物信息學(xué)方法成功將細(xì)菌的識別度精確至種水平(目前多數(shù)研究的細(xì)菌識別度僅能達(dá)到屬水平)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黑普氏菌(Prevotellamelaninogenica)在OLP頰黏膜表面構(gòu)成比顯著增加，且在目、科、屬、種各層次上的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，采用qPCR方法進(jìn)一步驗證了產(chǎn)黑普氏菌在OLP頰黏膜表面菌群的構(gòu)成比增加，提示產(chǎn)黑普氏菌可能在OLP發(fā)病過程中起到重要作用。

主坐標(biāo)分析顯示，糜爛型OLP與非糜爛型OLP頰黏膜表面菌群結(jié)構(gòu)均能與正常對照明顯分開，提示OLP頰黏膜表面菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著性改變；而糜爛型OLP組與非糜爛型OLP組交叉較多。既往研究也提示糜爛型與非糜爛型OLP病損表面微生物群落組成差別不大[6]。產(chǎn)黑普氏菌在糜爛型與非糜爛型OLP中的相對構(gòu)成比差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.3810)，推測該菌可能在健康向OLP進(jìn)展過程中發(fā)揮作用，而與OLP的類型無關(guān)，提示不同類型的OLP發(fā)病機(jī)制相似，僅為同一種疾病的不同狀態(tài)。

普氏菌(Prevotellaspecies)是黏膜部位如口腔、呼吸道、腸道等的共生菌[11]，是口腔唾液核心菌群之一[12]。產(chǎn)黑普氏菌屬于普氏菌中的一個種，是革蘭陰性厭氧球桿菌，在血平板上可產(chǎn)生黑色素，是與牙周炎[13]、根管內(nèi)及根尖周感染[14]密切相關(guān)的致病菌。越來越多的研究表明，在一些局部及系統(tǒng)性疾病如牙周炎、細(xì)菌性陰道炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、代謝紊亂及輕度系統(tǒng)性炎癥中，普氏菌在菌群中的相對豐度增加，且與Th17介導(dǎo)的黏膜炎癥相關(guān)[15]。普氏菌能夠通過刺激上皮角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-8，IL-6及CCL20，從而促進(jìn)黏膜Th17免疫反應(yīng)[16]。小鼠體內(nèi)定植實(shí)驗表明，普氏菌與炎癥性疾病具有因果關(guān)系[17]。與其他共生菌相比，普氏菌顯現(xiàn)出明確的刺激細(xì)胞炎癥因子釋放的促炎效應(yīng)[15，18]。產(chǎn)黑普氏菌在子宮內(nèi)膜炎中檢出占主導(dǎo)地位，達(dá)30%，被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜炎的致病菌[19]。該菌的LPS具有細(xì)胞因子誘導(dǎo)活性[20]，并可能通過T9SS分泌毒力因子致病[21]。

本實(shí)驗檢測了OLP活檢組織中產(chǎn)黑普氏菌的含量以及局部細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示與正常對照相比，OLP病損組織中該菌含量顯著增加且與IL-6表達(dá)水平成正相關(guān)，提示該菌可能是潛在致病菌，參與促進(jìn)了OLP局部免疫失衡。推測產(chǎn)黑普氏菌可能通過以下機(jī)制促進(jìn)OLP發(fā)病: 產(chǎn)黑普氏菌通過T6SS分泌蛋白酶[21]，破壞上皮屏障，在上皮屏障功能受損與上皮表面菌群失調(diào)的共同影響下，產(chǎn)黑普氏菌侵入到上皮基底層及固有層；侵入到細(xì)胞中的細(xì)菌作為靶抗原，被固有免疫細(xì)胞及上皮角質(zhì)細(xì)胞識別，激活NF-κB等通路，導(dǎo)致下游多種細(xì)胞因子、趨化因子的表達(dá)，CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞募集、浸潤并攻擊上皮角質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致基底細(xì)胞層液化變性，上皮屏障功能進(jìn)一步受損，這一惡性循環(huán)最終導(dǎo)致感染與慢性炎癥狀態(tài)的持續(xù)發(fā)生。

綜上所述，共生菌可能在促進(jìn)口腔扁平苔蘚免疫失衡中發(fā)揮重要作用，其具體機(jī)制值得深入研究。