鐘 鵬， 郁霞青， 陳志剛， 易婉婉， 賈成友， 呂中偉

(1. 同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海 200092; 2. 同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院呼吸科，上海 200433)

尿液作為血液經(jīng)過腎臟過濾的體液，可及時、如實地反映體內(nèi)的生理和病理情況。尿液還是真正意義上的無創(chuàng)取樣來源，可連續(xù)采集并含有多種成分[1]。最新用多種方法包括質(zhì)譜聯(lián)用可檢測到尿中蛋白數(shù)量6085種[2]，實體腫瘤患者的數(shù)量則會比正常人還要多近1000種[3]。尿液中總共超過3000多種代謝物[4]，還有循環(huán)核酸，包括循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)，循環(huán)RNA或微小RNA(miRNA)等[5]。但開發(fā)尿液在疾病診斷治療當(dāng)中應(yīng)用的研究卻任重道遠。尿液中miRNAs最開始作為標志物應(yīng)用在泌尿生殖系統(tǒng)疾病，且數(shù)量僅限200～300種[6]，但日本學(xué)者通過納米柱法可以從尿液中檢測到近1000種miRNAs，并且首次發(fā)現(xiàn)尿液中的某些miRNAs在非泌尿生殖系統(tǒng)以外的肺癌、肝癌、胰腺癌等疾病中也具有顯著差異表達[7]，因此開啟了尿液miRNAs在腫瘤診斷方面更廣闊的應(yīng)用前景。

確定內(nèi)參對于各種檢測的重要性都不言而喻，尿液中miRNAs的半定量檢測亦需要相應(yīng)的內(nèi)參基因來標定，但對于miRNAs的內(nèi)參標準卻有不同的報道。有報道在尿液中，HY3、RNU48[8]、5s RNA[9]、RNU44和U6[10]等均可作為尿液囊泡或血漿或尿液中miRNAs的內(nèi)參基因，但不同文章的結(jié)果卻不一致。

為了解決尿液中的內(nèi)參基因不一致的問題，本研究以非小細胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)患者和健康對照組為研究對象，通過BGISEQ-500 miRNA建庫和NGS，并用qPCR進行驗證，探討適用于正常人和NSCLC的尿液中的miRNAs內(nèi)參，期望能為今后尿液中miRNAs作為疾病診斷標志物提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2017年4月—2017年6月進入同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院行手術(shù)治療的患者。將患者術(shù)后的病理診斷結(jié)果作為“金標準”，從中選取確診為NSCLC患者，另外再招募健康志愿者。兩組參與者的年齡、性別及其他資料基本一致，見表1。NSCLC組患者為均未經(jīng)過手術(shù)或者其他治療的首次診斷患者，兩組參與者均無其他任何伴隨性慢性疾病。本研究向所有參與者講解了研究的內(nèi)容和意義，獲得了知情同意書，并得到了同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院倫理委員會的批準。

表1 NSCLC患者和健康對照者臨床信息

1.2 尿液收集與處理

收集NSCLC組術(shù)前和健康對照組第1次中段晨尿50mL離心(離心半徑20cm，4000r/min，離心10min)，去除細胞碎片后取尿液上清，再經(jīng)過Hybond-N+帶正電荷尼龍膜(通用電氣公司，美國)過濾后烘干[10]。將Hybond膜剪碎于潔凈Eppendorf管中，使用傳統(tǒng)TRIzol試劑(賽默飛世爾公司科技公司，美國)方法提取尿液上清中的總RNA。使用Nanodrop 2000(賽默飛世爾公司科技公司，美國)測定總RNA的濃度和質(zhì)量，D260/D280≥1.3。將總RNA放入-80℃超低溫保存箱(青島海爾股份有限公司，青島)中保存待使用。

1.3 BGISEQ-500 miRNA建庫和高通量測序

miRNA的處理過程，簡要而言，經(jīng)3′加頭和5′加尾，環(huán)化，擴增，測序等步驟構(gòu)建尿液中miRNA文庫。本次NSCLC組和健康對照組分別選擇12例和7例，總RNA樣品用干冰運送至華大基因公司由其來完成miRNA建庫、測序和生物信息學(xué)分析。根據(jù)高通量測序結(jié)果中的TPM值篩選出高豐度前5位在NSCLC組和健康對照組尿液中表達較一致且是組成性表達的miRNA，作為候選內(nèi)參基因用于后面的實驗驗證過程。

1.4 cDNA的合成

將總RNA樣品在相同的起始量(0.35ng)下進行反轉(zhuǎn)錄，加尾法反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis(寶生物工程有限公司，日本)。具體操作步驟嚴格按照試劑盒的說明書進行。

1.5 候選內(nèi)參基因全長(mimics)及引物的合成

內(nèi)參基因序列信息來自RNA Central網(wǎng)站(https:∥rnacentral.org/)，成熟的miRNA的序列信息來自miRbase(http:∥www.mirbase.org/)網(wǎng)站，使用primer premier 5軟件設(shè)計候選內(nèi)參基因的上游引物。下游引物為試劑盒(寶生物工程有限公司，日本)中通用的mRQ3′ primer。miRNA的引物和全長由上海桑尼生物科技有限公司幫助合成。

1.6 qPCR驗證

使用Bio-RAD公司(美國)的Bio-RAD CFX96TM Real-Time System進行qPCR反應(yīng)，對候選內(nèi)參基因進行驗證。反應(yīng)體系為: 2×qPCR Mix 7.5μL、候選內(nèi)參基因上游引物0.5μL(10μmol/L)、下游通用引物mRQ3′ primer 0.5μL(10μmol/L)和cDNA 1μL，總體積為15μL。反應(yīng)條件為: 預(yù)變性95℃ 3min，變性95℃ 3s，退火60℃ 30s，40個循環(huán)；熔解溫度62℃～95℃。不含cDNA的樣本為陰性對照，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 確定NSCLC組和健康對照組尿液中的候選內(nèi)參基因

高通量測序結(jié)果，通常用TPM來表達轉(zhuǎn)錄本的豐度。本研究中根據(jù)TPM的豐度，選擇豐度從高到低的，并且在兩組中表達量較一致(同一樣本用算術(shù)平均數(shù)和中位數(shù)兩種計算方式)的RNA作為候選內(nèi)參基因，見表2。篩選出5S rRNA、tRNA、18S rRNA和28S rRNA和U6作為候選內(nèi)參基因進行后續(xù)實驗。

表2 測序后基于TPM值遴選的NSCLC組和健康對照組尿液中的候選內(nèi)參基因

2.2 候選內(nèi)參基因的標準曲線

將人工合成的候選內(nèi)參基因全長反轉(zhuǎn)錄，起始濃度為10μmol/L，用Easy Dilution(寶生物工程有限公司，日本)溶液稀釋64倍，之后以4倍作為一個稀釋梯度，最后稀釋到220，總計8個濃度稀釋梯度。用合成的各候選內(nèi)參基因的引物(表3)在qPCR反應(yīng)中測定各稀釋濃度下cDNA的Ct值，并繪制標準曲線，見圖1。線性相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，說明合成的標準曲線的濃度與Ct值的線性非常好，檢測試劑的可靠性也非常高，在220稀釋時仍在線性范圍。并且各候選內(nèi)參基因在人工合成RNA全長和尿液RNA樣本中的熔解曲線都是明顯的單一峰，說明引物特異性較好，無非特異性擴增。

2.3 候選內(nèi)參基因在驗證組尿液樣本中的表達

另外選取NSCLC組和正常對照組尿液樣本各8例，將等量的RNA(0.35ng)經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA分別稀釋到64、256和1024倍，探究各內(nèi)參基因在尿液樣本中的表達豐度(表4)和表達的穩(wěn)定性(圖2)。由qPCR的結(jié)果可知，5S rRNA在樣品中的含量最高，其次為18S rRNA和28S rRNA，而tRNA和U6在尿液樣本中的表達量最低。各候選內(nèi)參基因在NSCLC組和健康對照組中的表達量幾乎完全相同(P>0.05)且不同稀釋倍數(shù)的線性關(guān)系也特別好。

表3 候選內(nèi)參基因的上游引物

圖1 5S rRNA、tRNA、U6、18S rRNA和28S rRNA 全長濃度梯度標準曲線Fig.1 RNA full-length standard curves for 5S rRNA, tRNA, U6, 18S rRNA and 28S rRNA according to different concentrations橫坐標為稀釋倍數(shù)以2為底數(shù)的對數(shù)值，縱坐標為qPCR結(jié)果中的Ct值

圖2 各候選內(nèi)參基因在NSCLC組和健康 對照組中的Ct值Fig.2 Ct values of each candidate internal reference gene in the NSCLC group and the healthy control group cDNA稀釋64倍，箱形上下線分別代表上下四分位數(shù)，箱形中間的橫線代表中位數(shù)，最上面的橫線代表最大值，最下面的橫線代表最小值

表4 qPCR驗證候選內(nèi)參基因在驗證組尿液樣本中的表達

2.4 分析候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性

利用geNorm軟件、NormFinder軟件和Bestke-eper軟件對候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性進行分析。根據(jù)geNorm軟件計算基因穩(wěn)定表達值M的大小，見表5，各候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性由高到低: 18S rRNA和28S rRNA(0.935)>U6(1.098)>5S rRNA(1.24)>tRNA(1.519)。NormFinder軟件的結(jié)果與geNorm軟件結(jié)果一致。根據(jù)BestKeeper軟件的結(jié)果，tRNA的s值大于1，不適合作為內(nèi)參基因。其它4個候選基因都可以作為NSCLC組和健康對照組尿液中miRNAs表達分析的內(nèi)參基因。其中28S rRNA的s值和U6的CV值最小，表達最穩(wěn)定。另外，18S rRNA的相關(guān)系數(shù)(r)最大，表明它最適合與其他候選內(nèi)參基因聯(lián)合使用。

表5 geNorm軟件、NormFinder軟件和BestKeeper軟件分析結(jié)果

3 討 論

“固體活檢”，也稱組織活檢，因其侵入性、滯后性、無法重復(fù)采樣而不能及時反映腫瘤最新動態(tài)或指導(dǎo)腫瘤的敏感性治療。因此，開發(fā)具有重要價值的非侵入性檢測方法極為迫切。

選擇合適的內(nèi)參基因?qū)嶒灲Y(jié)果的準確描述至關(guān)重要[11]。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該符合以下條件: 在所有樣品中都可以被檢測到；有中等到較高水平的表達；表達量在樣品之間一致性較好[12]。U6是經(jīng)典的內(nèi)參基因，經(jīng)常用在組織和細胞的定量分析中[13]。但是U6在體液中(如血液和尿液等)表達的穩(wěn)定性在不同的實驗中結(jié)果迥然不同，可能是因為其片段長度大于100bp，易被體液中的核酸酶降解。血液循環(huán)系統(tǒng)中常用的內(nèi)參基因有Let-7a、Let-7d、Let-7g、miR-16、U6、U48、miR-191、miR-484和miR-520d-5p等，其中U6和miR-520d-5p在血液中的含量是穩(wěn)定的[14]，通常用U6作為血液檢測miRNA的內(nèi)參[15]。而更多的實驗表明U6在血液中的表達量有較大差異，在如肝癌、膀胱癌、食管鱗狀細胞癌和其他一些代謝性疾病[16-20]中并不適合作為內(nèi)參使用。

目前對尿液中內(nèi)參基因的選擇仍然缺乏系統(tǒng)研究。尿液中的miRNAs特點是含量很低，只占總RNA的0.01%，對實驗操作和內(nèi)參選擇一致性的要求更加嚴格[21]。本研究首先根據(jù)尿液中RNA的高通量測序結(jié)果，選擇出在NSCLC組和健康對照組中表達較一致的5S rRNA、tRNA、18S rRNA和28S rRNA，和U6一起作為候選內(nèi)參基因。并在驗證組樣本中在起始量一致時用qPCR檢測并驗證。再通過geNorm軟件、NormFinder軟件和BestKeeper軟件對候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行評價后，表明28S rRNA的穩(wěn)定性最好且豐度較高，最適合作為尿液中miRNA的內(nèi)參基因，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合是18S rRNA和28S rRNA。而tRNA和U6在尿液中的表達不夠穩(wěn)定，且U6的豐度較低，不適合作為內(nèi)參基因使用。5S rRNA可能因為濃度太高反而不適合做內(nèi)參。高通量測序的原理也是基于PCR擴增產(chǎn)物信息的讀取，所以會存在因擴增效率差異而出現(xiàn)與qPCR結(jié)果不一致的情況。本實驗各樣本的TPM值與qPCR結(jié)果基本一致。本實驗結(jié)果顯示: 尿液中的內(nèi)參表達豐度非常高。以18S rRNA為例，起始量為0.35ng的模板，經(jīng)過64、256和1024倍稀釋后，其Ct值分別是21.72、24.93和26.10，而一般細胞學(xué)實驗的起始模板量為25～50ng，不同的內(nèi)參及GAPDH或actin等的Ct值一般在20左右?？梢姳痉椒ǖ目煽啃院头€(wěn)定性非常高，為肺癌等疾病通過尿液中miRNA的檢測定量提供了非常重要和堅實的實驗基礎(chǔ)。

本實驗所采用的收集尿液方法是基于帶正電荷的尼龍膜過濾并吸附核酸[22]，其孔徑是200nm(目前此材料最小孔徑)，可以截留住直徑大于200nm的細胞外囊泡顆粒或更小的細胞外囊泡所形成的復(fù)合體或游離的核酸。本研究所采用的膜過濾方法雖簡單有效，且膜干燥可長期保存樣本，但也存在不足之處，如可能無法截流直徑小于膜孔徑的囊泡顆粒，另外本課題所研究的病種偏少，不能全面反映所有腫瘤患者表達的情況。在進一步工作中可進行大樣本和多病種的對比研究，為尿液診斷不同疾病打下堅實的實驗基礎(chǔ)。