(1.湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 長沙 410127； 2.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院， 北京 100083)

海南蝴蝶蘭(Phalaenopsishainanensis)又名海南蝶蘭，是蘭科蝴蝶蘭屬的多年生植物，為我國海南特有。因狹域分布、生境退化以及人工采挖，海南蝴蝶蘭的種群數(shù)量明顯下降，瀕臨滅絕，為我國Ⅰ級極危(CR)珍稀瀕危植物，物種受威脅程度僅次于絕滅(EX)、野外絕滅(EW)[1]，對其開展搶救性保護(hù)刻不容緩。目前，海南蝴蝶蘭在野外已經(jīng)非常稀少，利用外植體直接進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)已經(jīng)難以實(shí)現(xiàn)，且會破壞現(xiàn)有的少量植株，無菌播種是目前對其進(jìn)行保存的重要方式之一。通過種子無菌萌發(fā)，可以在不破壞母株的情況下，在較短時間內(nèi)獲得大量幼苗，能有效地保護(hù)海南蝴蝶蘭的種質(zhì)資源，也為它的后續(xù)開發(fā)利用提供珍貴的原材料。當(dāng)前，有關(guān)海南蝴蝶蘭組培快繁的報道很少[2]。為了更好的保護(hù)海南蝴蝶蘭，本試驗(yàn)對海南蝴蝶蘭進(jìn)行了無菌萌發(fā)研究，從基本培養(yǎng)基種類及有機(jī)添加物作用等方面進(jìn)行了試驗(yàn)，并通過試管育苗成功培育出了一批海南蝴蝶蘭幼苗。

1 材料與方法

1.1 材 料

表1 不同基本培養(yǎng)基對種子無菌萌發(fā)的影響

指標(biāo)培養(yǎng)基處理1處理3處理5處理7處理9種子平均萌發(fā)率/%1.4±0.07a1.6±0.02d1.9±0.04e2.5±0.07b3.2±0.06c

注:不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。

試驗(yàn)材料為海南蝴蝶蘭的成熟蒴果。

1.2 方 法

1.2.1蒴果無菌處理

取海南蝴蝶蘭成熟蒴果，用洗潔精清洗表面，流水沖洗2 h，再用75%酒精表面滅菌1 min，無菌水沖洗2次，然后在10%NaClO溶液中消毒30 min。在無菌條件下，切開蒴果，取出種子，放入無菌水中，搖勻，制成種子溶液。

1.2.2無菌播種處理

取搖勻后的1 mL(顯微鏡下觀測均值約1 000粒)種子溶液轉(zhuǎn)移到無菌萌發(fā)培養(yǎng)基上，均勻分布。

為測定種子無菌萌發(fā)情況，設(shè)置了12個不同的處理。處理1：MS；處理2：MS+100 mL·L-1椰子汁；處理3：VW；處理4：VW+100 mL·L-1椰子汁；處理5：KC；處理6：KC+100 mL·L-1椰子汁；處理7：1/2 MS；處理8：1/2 MS+100 mL·L-1椰子汁；處理9：1/4 MS；處理10：1/4 MS+100 mL·L-1椰子汁；處理11：1/2 MS+100 g·L-1香蕉泥；處理12：1/2 MS+100mL·L-1椰子汁+100 g·L-1香蕉泥。每個處理均添加3%蔗糖、0.6%瓊脂、0.2%活性炭(AC)，pH調(diào)節(jié)至5.6?？刂茰囟?25±2)℃，光照強(qiáng)度30～40μmol·(m2·s)-1，光照時長14 h·d-1。

1.2.3植株再生處理

1) 原球莖的增殖與分化。

在1/2 MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1培養(yǎng)基上對種子萌發(fā)產(chǎn)生的原球莖進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

用1/2 MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1對增殖后的原球莖進(jìn)行誘導(dǎo)分化。

2種培養(yǎng)基均添加3%蔗糖、0.6%瓊脂、0.2%活性炭、100 g·L-1的香蕉泥，pH調(diào)節(jié)至5.6?？刂茰囟?25±2)℃，光照強(qiáng)度30～40μmol·(m2·s)-1，光照時長14 h·d-1。

2) 壯苗與生根。

將分化后的幼苗轉(zhuǎn)入MS+NAA 0.1 mg·L-1。

以上培養(yǎng)基中加入3%蔗糖、0.6%瓊脂、0.2%活性炭、100 g·L-1香蕉泥，pH調(diào)節(jié)至5.6。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照強(qiáng)度30～40μmol·(m2·s)-1，光照時長14 h·d-1。

3) 試管苗的移栽。

將試管苗(8～10 cm高、有6～8條粗壯的根、同時根長達(dá)4～8 cm)煉苗3～5 d，然后移栽在消毒過的水苔中。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對海南蝴蝶蘭種子萌發(fā)的影響

為探討基本培養(yǎng)基對種子無菌萌發(fā)的影響，本試驗(yàn)分別設(shè)置了5個不同的處理。處理1：MS；處理3：VW；處理5：KC；處理7：1/2 MS；處理9：1/4 MS。每個處理為1種基本培養(yǎng)基。以種子形成綠色原球莖記為萌發(fā)。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

由表1可知，海南蝴蝶蘭種子在5種基本培養(yǎng)基上都能萌發(fā)，但差異顯著。在1/4 MS上的萌發(fā)率最高。

2.2 不同有機(jī)添加物對海南蝴蝶蘭種子萌發(fā)的影響

為研究有機(jī)添加物對種子無菌萌發(fā)的影響，本試驗(yàn)設(shè)置了4個不同的處理。處理7：1/2 MS；處理8：1/2 MS+100 mL·L-1椰子汁；處理11：1/2 MS+100 g·L-1香蕉泥；處理12：1/2 MS+100 mL·L-1椰子汁+100 g·L-1香蕉泥。結(jié)果見表2。

表2 有機(jī)添加物對種子無菌萌發(fā)的影響

培養(yǎng)基種子萌發(fā)率/%處理71.4±0.23c處理83.5±0.23a 處理111.9±0.12b 處理123.9±0.33a

從表2可以看出，椰汁跟香蕉泥均能明顯促進(jìn)海南蝴蝶蘭種子的無菌萌發(fā)，100 mL·L-1椰汁與100 g·L-1香蕉泥相比，效果更顯著。單加椰汁與同時添加椰汁、香蕉泥的培養(yǎng)基效果不明顯。

3 結(jié)論與討論

3.1 基本培養(yǎng)基

蘭科植物無菌萌發(fā)常用的基本培養(yǎng)基有KC、花寶、VW、RE、MS、1/2 MS、1/4 MS等[3-9]。本試驗(yàn)結(jié)果表明海南蝴蝶蘭無菌萌發(fā)的最適基本培養(yǎng)基為1/4 MS。

3.2 有機(jī)添加物

椰子汁、香蕉泥、土豆泥等有機(jī)添加物富含氨基酸、激素和酶等[10]，能促進(jìn)蘭科植物種子的無菌萌發(fā)[3,5,11-16]及幼苗的生長發(fā)育[7,17]。本試驗(yàn)結(jié)果與前人報道一致，有機(jī)添加物能明顯促進(jìn)海南蝴蝶蘭種子的無菌萌發(fā)，100 mL·L-1的椰汁較100 g·L-1的香蕉泥效果更顯著。

3.3 無機(jī)鹽

無機(jī)鹽的種類、配比、濃度會影響蘭科植物原球莖的增殖和分化[18-19]。一般情況下較低濃度無機(jī)鹽有利于原球莖的增殖[8]與分化[20]。本試驗(yàn)過程中，對種子無菌萌發(fā)產(chǎn)生的原球莖進(jìn)行增殖培養(yǎng)，10 d后原球莖萌動，30 d后原球莖增殖明顯，說明添加了100 g·L-1香蕉泥的培養(yǎng)基1/2 MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1適于原球莖增殖。把增殖后的原球莖轉(zhuǎn)入添加了100 g·L-1香蕉泥的培養(yǎng)基1/2 MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1中，30 d后原球莖分化出芽，表明該培養(yǎng)基可用于海南蝴蝶蘭的原球莖分化培養(yǎng)。

無機(jī)鹽的種類、配比、濃度也會對蘭科植物的壯苗生根產(chǎn)生影響。活性炭具有很強(qiáng)的吸附能力,能吸附分泌到培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，減少褐變[4,21]，提高生根速率以及促進(jìn)根伸長[22]。在培養(yǎng)基中加入活性炭，可有效防止試管苗褐變[11-12,23]。本試驗(yàn)將原球莖分化獲得的幼芽接種于壯苗與生根培養(yǎng)基上，接種10 d左右的小芽下部開始膨大，產(chǎn)生綠色突起，30 d后生根，生根率100%。60 d后根系發(fā)達(dá)，每一植株均具5～6條粗根，且葉片肥厚，有4～6片。說明添加了100 g·L-1香蕉泥的培養(yǎng)基MS+NAA 0.1 mg·L-1適于海南蝴蝶蘭的壯苗與生根培養(yǎng)。

3.4 移栽基質(zhì)

水苔營養(yǎng)物質(zhì)豐富，保水透氣性好，為蝴蝶蘭常用的移栽基質(zhì)[17,24]。本試驗(yàn)中海南蝴蝶蘭在壯苗生根培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，直到試管苗達(dá)到移栽要求時進(jìn)行煉苗，然后移栽于水苔中，移栽30 d后，植株健壯，成活率100%，且葉片濃綠肥大，接近成株葉片大小，表明水苔適于海南蝴蝶蘭的移栽。

3.5 研究意義

蘭科植物常以葉片、花梗、根尖或莖尖為外植體進(jìn)行離體保存，與這種方式相比，本試驗(yàn)采用的種子無菌萌發(fā)，能在短時間內(nèi)得到大量幼苗，同時大幅度減少了試驗(yàn)對植物材料的需求量，極大地保護(hù)了珍稀瀕危物種的現(xiàn)有數(shù)量，同時也降低了試驗(yàn)難度，縮短了試驗(yàn)時間，對海南蝴蝶蘭種質(zhì)資源的保護(hù)具有現(xiàn)實(shí)意義。