董安憶， 楊亞桐， 牛青敏， 劉松濤， Zenda Tinashe， 段會軍

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)/華北作物種質(zhì)資源研究與利用教育部重點實驗室， 河北 保定 071001)

甜玉米(sweeten corn)是普通玉米胚乳基因突變而來的，是玉米種群中的一個變種，由于胚乳中和糖分轉(zhuǎn)化有關(guān)的基因發(fā)生突變，使淀粉合成受阻，導(dǎo)致糖分大量積累。甜玉米比普通玉米具有更高的營養(yǎng)價值，籽粒中富含更多的維生素和氨基酸等營養(yǎng)元素，平均籽粒氨基酸含量比普通玉米高23.2%，蛋白質(zhì)含量比普通玉米高1倍左右，葡萄糖、蔗糖和果糖含量高7倍，硒的含量高8～10倍[1-3]。

過氧化物酶基因是一個多基因家族,在植物體中活性較高，且在生物界中廣泛存在，與植物的氧化作用、呼吸作用和生長素在體內(nèi)的化學(xué)作用休戚相關(guān)[4-5]。過氧化物酶為細胞抵御活性氧傷害的重要酶系統(tǒng)[6]，隨著植物的生長發(fā)育，過氧化物酶工作重心會做出相應(yīng)調(diào)整，用以配合穩(wěn)定生物體代謝過程[7]，調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)[8]，過氧化物酶基因為多基因家族，眾多研究表明通過脅迫刺激可以影響其表達[9-10]。

國內(nèi)外研究學(xué)者在過氧化物酶研究方面已經(jīng)做了大量的工作。任曉月等基于過氧化物酶多態(tài)性，運用聚丙烯酰胺凝膠電泳垂直板電泳技術(shù)對不同地區(qū)羅布麻進行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示其Rf值在0.547～0.882之間，親緣關(guān)系較近[11]。陳雯等運用聚丙烯酰胺凝膠電泳垂直板電泳技術(shù)對麻瘋樹進行過氧化物酶分析，其遺傳距離在0.72～1.0范圍內(nèi)[12]。劉文倩等對12種不同表型的披針葉八角植物進行過氧化物酶分析，在相似系數(shù)為0.7處可將供試植物分為3類，與其來源地有較高的相關(guān)性[13]。趙廣華對19種木蘭科植物進行過氧化物酶遺傳分析，結(jié)果表明，供試材料被分為4類[14]，與《中國植物志》[15]中的分類基本一致。

表2 10對引物序列

引物名稱序 列 引物名稱序 列 Pox1F5'-CTCGACCTACAAGGAC-3'Pox1R5'-ATGTAGGCGCTGGTGA-3'Pox2F5'-CTCGACGTCAAGGACCTC-3'Pox2R5'-GCCCATCTTCACCATGG-3'Pox3F5'CAACGAAGACCAACATCGA-3'Pox3R5'-CCTGATCTGTCCCTGCG-3'Pox4F5'-CACCATCAAGAGCGTCATAAC-3'Pox4R5'-TTGGGCGTCGTCGTGT-3'Pox5F5'-GGCGTCGGCGTCG-3'Pox5R5'-ATCGGGAAGCTTCCCCTC-3'Pox6F5'-CCACGCCCTCATCGC-3'Pox6R5'-CATCTGGCCGTGCGTC-3'Pox7F5'-CCTTCTTCTTGCCATCTTGC-3'Pox7R5'-CATATCGCTCCACGACCTTT-3'Pox8F5'-CGAGCTGAGAGTGAATCGATC-3'Pox8R5'-CTTGAACGCCTGGATGAGC-3'Pox9F5'-GACGGTTCTATTGGGAAGAAG-3'Pox9R5'-CATGAAAGTGATGAGATGGC-3'Pox10F5'-CTCATCGTTAACGTCGCATC-3'Pox10R5'-GATGCAAGGAGTATAGTGCAAATG-3'

注：F為正向引物，R為反向引物。

雖然利用過氧化物酶基因多態(tài)性(POGP. Peroxidase gene polymorphism)在多種植物中進行了研究，但是在甜玉米種質(zhì)中報道的還很少。本研究利用過氧化物酶保守區(qū)域設(shè)計引物對甜玉米種質(zhì)進行過氧化物酶基因多態(tài)性評價，以明確甜玉米種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為甜玉米育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的34份材料(表1),均為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米育種團隊從全國各地收集。

1.2 試驗方法

1.2.1DNA提取與濃度測定

通過利用CTAB法[15-17]對供試的34份甜玉米進行基因組葉片DNA提取，然后用紫外分光光度計測量DNA的濃度，之后放置在-20 ℃的冰箱中保存以備使用[18-19]。

1.2.2引物設(shè)計

基于玉米過氧化物酶cDNA序列設(shè)計引物，這些序列可在National Center for Biotechnology Information(NSBI,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上找到。使用Clustalx 軟件對過氧化物酶cDNA序列進行序列相似性聚類及比對，找到相似性序列即保守區(qū)域序列。根據(jù)正向引物和反向引物的退火溫度調(diào)整引物長度(表2)。

表1 34份甜玉米自交系

編號名稱來源編號名稱來源1116379河北18M6-1-6河北2甘甜2甘肅19M5-1河北3紅M7河北20M5-c河北4紫Su5-12河北21石黃甜河北5TS河北22116375河北6保甜1河北23白甜1河北7116359河北24紫Su5-3河北8116329河北25116327河北9超甜玉米-3河北26紫Su5-3-3河北10GT4不詳27116432河北11甘紫甜1甘肅28GT1不詳12M638河北29黃粘甜不詳13超甜-1河北30116394河北14116484河北31MS河北15116377-78河北32HHT海南16116424河北33超甜-2河北17116469河北34116385河北

1.2.3PCR擴增

PCR 反應(yīng)體系為 25μL，包括5 ng·μL-1DNA 模板 2μL，10μmol·L-1前后引物各 1μL，10×Buffer 2.5μL， dNTP 1.6μL，TaqDNA 聚合酶0.3μL，去離子水16.6μL，待體系混合均勻后加入1小滴礦物油(全過程在冰盒上進行)。

PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR 擴增在 Biometra 型 PCR 儀上進行。擴增完成后，放入4 ℃保存。

圖1 POX 2引物擴增電泳圖

1.2.4瓊脂糖凝膠電泳

擴增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離檢測。然后，把電泳完成后的凝膠放入BIO RAD凝膠成像系統(tǒng)(Serial No:721 BR 13708)中進行觀察記錄[20-21]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以 0、1 記錄凝膠電泳結(jié)果，在指定遷移位置有帶記為 1，無帶記為 0，缺失記為9，構(gòu)建所有引物擴增結(jié)果數(shù)據(jù)庫。利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行聚類分析和遺傳相似性分析，構(gòu)建相似性矩陣，利用組內(nèi)聯(lián)接的聚類分析方法研究甜玉米種質(zhì)間的遺傳關(guān)系。

2 結(jié)果分析

2.1 擴增結(jié)果分析

利用10對引物對34 份甜玉米種質(zhì)進行擴增(圖1)。共擴增出了34條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶21條，占擴增總帶數(shù)的61.76%，表明10對不同引物組合(表2)的多態(tài)性存在明顯差異(表3)。

表3 10對引物組合對34份甜玉米材料的擴增結(jié)果

引物總帶數(shù)多態(tài)性帶數(shù)多態(tài)性頻率/%Pox18675.0Pox25480.0Pox322100.0Pox43133.3Pox53133.3Pox622100.0Pox73266.67Pox82150.0Pox93133.3Pox103133.3總計342161.76

2.2 基于過氧化物酶基因的遺傳多樣性分析

據(jù)SPSS軟件統(tǒng)計，34份甜玉米種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)顯示,遺傳相似系數(shù)越大表明親緣關(guān)系越近，反之親緣關(guān)系越遠。本試驗遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.674～0.978，說明供試材料間遺傳分化不明顯，本試驗甜玉米種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)相對狹窄。

2.3 基于過氧化物酶基因標(biāo)記的甜玉米品種的聚類分析

根據(jù)遺傳相似系數(shù)矩陣，基于歐式距離對供試玉米自交系進行組內(nèi)聯(lián)接的聚類分析樹狀圖(圖2)結(jié)果顯示，可以將34份甜玉米自交系分為4類，其中第一大類材料包括石黃甜，紫Su 5-3，116375，116329，紫Su 5-12,116359,116484,116377-78和116394；第二大類有GT 4,M 5-c，超甜玉米-3，116469,TS和黃粘甜；第三大類材料包括116379，甘甜2，HHT,超甜-2,白甜1，超甜-1和MS；第四大類材料包括M 638,M 616，116327，紫Su 5-3-3,116432,紅M 7，116385,保甜1，甘紫甜1,116424，M 5-1和GT 1。其中第一大類為普通甜玉米，第二，三，四類為超甜玉米。

3 討 論

利用過氧化物酶高度保守區(qū)域設(shè)計引物已應(yīng)用于大豆[22]、煙草[23]、水稻[24]、棉花[25]，這為甜玉米遺傳多樣性研究提供了有力的理論指導(dǎo)。劉志雄認為，獲得SSR分子標(biāo)記一般需要建立、篩選基因文庫,克隆測序,引物設(shè)計等,耗費大量人力物力[26]。胡建廣等認為，RAPD引物較短，PCR退火溫度相對較低，重復(fù)性較差[27]。因此，利用SSR或RAPD都存在著一些不足，而本研究利用過氧化物酶保守區(qū)域設(shè)計引物結(jié)果顯示，10對引物共擴增出了34條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶21條，占擴增總帶數(shù)的61.76%。其帶型片段顯示重復(fù)穩(wěn)定，說明了該技術(shù)的準確性，高效性。因此，利用過氧化物酶保守區(qū)域設(shè)計引物對甜玉米種質(zhì)進行遺傳分析是一種真實可靠的工具。

本試驗對34組甜玉米材料進行聚類分析，將其劃分為四大類。其中，超甜玉米姊妹系M 638和M 616被劃分在FCGⅣ中，說明其遺傳關(guān)系較近；親緣關(guān)系較近的紫Su 5-12、紫Su 5-3在一個類群中，其中紫Su 5-3-3不與其在同一類，可能是由于品種混雜，環(huán)境因素也可能是由于所用引物數(shù)量的限制使之未被精確分類等。遺傳相似系數(shù)范圍為0.674～0.978，表明所選材料遺傳基礎(chǔ)比較狹窄,這與馮艷等[28]、張姿麗等[29]的結(jié)果基本一致。因此，要注重甜玉米資源的引進與發(fā)掘，從而拓寬甜玉米種質(zhì)資源多樣性?？傊垲惙治隹梢员容^準確快速地對甜玉米進行類群劃分，對甜玉米親緣關(guān)系研究具有一定的參考價值[30]。

綜上所述,利用過氧化物酶高度保守區(qū)域設(shè)計引物對甜玉米種質(zhì)進行過遺傳多態(tài)性分析,對于甜玉米種質(zhì)資源的研究、改良、優(yōu)化、雜交親本組配具有一定的參考價值。但還應(yīng)結(jié)合甜玉米的田間表現(xiàn)、生理生化指標(biāo)、配合力[31]等來推斷其遺傳多樣性[32]，從而深化對甜玉米種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究與合理利用。

圖2 34份自交系基于歐氏距離的聚類分析圖