高德友,鄭學(xué)淵

摘要：鱟的血淋巴中所存在的鱟素（tachyplesin）為抗菌肽的一種，本研究使用中國(guó)鱟（Tachypleus tridentatus）為研究材料，自鱟血細(xì)胞中以高效液相層析儀萃取鱟素，并利用電泳分析測(cè)定其分子量，確定所萃取蛋白質(zhì)為鱟素，以之進(jìn)行水產(chǎn)常見(jiàn)病原的抗菌試驗(yàn)，希望作為未來(lái)新藥開(kāi)發(fā)以及運(yùn)用生物技術(shù)防范病害的可能。以不同濃度的鱟素進(jìn)行細(xì)菌的抗菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)鱟素有顯著的抗菌效果。在低濃度鱟素處理組中（1及2 μg/ml），24小時(shí)內(nèi)各細(xì)菌間之活存率沒(méi)有顯著差異（<0.05），鱟素對(duì)于Vibrio alginolyticus、Aeromonas hydrophila、Lactococcus garvieae 以及 Photobaterium damselae之半致死劑量（LD50）分別為7.31 μg/mL、13.26 μg/mL、15.27 μg/mL及6.68 μg/mL。以50 μg/mL鱟素加入菌液經(jīng)過(guò)24小時(shí)后，V. alginolyticus、A. hydrophila、L. garvieae及P. damselae之活存率分別只有5.8%、11.6%、18.9%及3.2%，顯示鱟素對(duì)于上述細(xì)菌具有一定的抑菌作用。

關(guān)鍵詞：鱟;鱟素;抑菌作用;抑菌肽

中圖分類(lèi)號(hào)：Q2-3 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

抗菌肽（antimicrobial peptides， AMPs）廣泛分布在許多的生物體中，在如蜜蜂（Apis melliferal） 刺裡的毒液中所發(fā)現(xiàn)的抗菌肽-melittins [1]、比目魚(yú)（Pleuronectes americanus）中所發(fā)現(xiàn)的抗菌肽-pleurocidin [2]、植物wheat seeds中所發(fā)現(xiàn)的抗菌肽-purothionins [3]，甚至在人類(lèi)的嗜中性白血球 （neutrophils）、單核球細(xì)胞（monocyte）及T淋巴球細(xì)胞 （T lymphocyte） 中所發(fā)現(xiàn)的抗菌肽-LL-37 [4]，都可以發(fā)現(xiàn)到抗菌肽的存在。

抗菌肽的研究大約是由80年代開(kāi)始興起。Hultmark等人[5]由天蠶（Hyalophora cecropia）中分離純化得到具有抗菌性的多肽鏈-cecropin后，學(xué)者便相繼由細(xì)菌、昆蟲(chóng)、植物、哺乳動(dòng)物甚至人類(lèi)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)到抗菌勝肽的存在。目前所發(fā)現(xiàn)的抗菌勝肽已有800多種?？咕目山逵善浣Y(jié)構(gòu)區(qū)分為雙性和疏水性螺旋肽 （amphipathic and hydrophobic α-helices）、β-褶板肽及較小的蛋白質(zhì) （β-Sheet peptides and small proteins）以及擁有特殊胺基酸組成的抗菌勝肽等[6]。

鱟素（tachyplesin）為含有17個(gè)胺基酸的β-褶板肽，分子量約為2.36 kDa。鱟素具有抑菌作用，另外對(duì)于部分真菌如Candida albicans [7]，以及對(duì)于腫瘤細(xì)胞亦有抑制的效果[8]。過(guò)去對(duì)抗細(xì)菌多使用抗生素，造成細(xì)菌對(duì)抗生素的抗藥性正快速增加，而對(duì)抗此一現(xiàn)象的方法以天然型態(tài)的抗菌肽最有潛力。

近年來(lái)水產(chǎn)養(yǎng)殖出現(xiàn)大量細(xì)菌性疾病，造成在魚(yú)介貝類(lèi)養(yǎng)殖的重大損失，本研究以中華鱟（Tachypleus tridentatus）為材料，取其血細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，收集其鱟素進(jìn)行水產(chǎn)養(yǎng)殖常見(jiàn)之病原菌如Vibrio alginolyticus、Aeromonas hydrophila、Lactococcus garvieae以及 Photobaterium damselae之抗菌試驗(yàn)，以了解鱟素對(duì)上述菌的抑菌作用，希望做為未來(lái)水產(chǎn)新藥開(kāi)發(fā)以及運(yùn)用生物技術(shù)防范病害的可能，因此抗菌勝肽的研究在目前醫(yī)學(xué)的發(fā)展及疾病的控制中是刻不容緩的課題。

1 ?材料與方法

1.1 ?鱟的來(lái)源與畜養(yǎng)

鱟收購(gòu)后先蓄養(yǎng)于檢疫預(yù)備槽，經(jīng)用淡水沖洗污泥，并進(jìn)行消毒去除寄生蟲(chóng)后再移入蓄養(yǎng)池，蓄養(yǎng)兩周后可進(jìn)行抽血，蓄養(yǎng)環(huán)境底部放置細(xì)沙，并以過(guò)濾后之海水進(jìn)行蓄養(yǎng)，蓄養(yǎng)其間每?jī)商焱段挂淮谓鈨龅纳D，包括下雜鮮魚(yú)、小卷、烏賊、牡蠣及帶殼蝦子做為飼料。

1.2 ?鱟血淋巴抽取

抽血所使用的玻璃器皿，先以界面活性劑清洗后，用超音波震蕩清洗一小時(shí)，經(jīng)二次蒸餾去離水沖洗后、瀝干，以鋁箔紙包好于180℃干熱滅菌4小時(shí)后備用。采血部位為后頭胸甲部與腹甲部交接關(guān)節(jié)韌帶中央，采血時(shí)先將腹甲固定，將頭胸甲與腹甲間關(guān)節(jié)曲折并固定，使鱟不易掙脫。采血部位先以?xún)?yōu)碘及70%酒精的棉棒消毒，代表面干后，以1 1/2” 18G無(wú)熱原針頭穿透韌帶膜即可達(dá)后圍心腔進(jìn)行采血。采取之血液與抗凝血?jiǎng)┚鶆蚧旌希谧⑷霟o(wú)熱原離心管中，進(jìn)行離心。

細(xì)胞培養(yǎng)皿先以0.1 mg/mL 之poly-L-lysine進(jìn)行涂抹，在直徑100 ㎜及150 ㎜的細(xì)胞培養(yǎng)皿中放入poly-L-lysine，半小時(shí)后回收使用并用無(wú)菌水清洗兩次，放置于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)烘干即可，以利細(xì)胞黏著。細(xì)胞培養(yǎng)液的配方以DMEM為主酸堿值調(diào)整至7.4，將鱟血細(xì)胞培養(yǎng)在直徑150 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于37℃，10% CO2/90%air，濕度100%的培養(yǎng)箱（incubator）進(jìn)行培養(yǎng)，每隔二至三天更換新培養(yǎng)液。培養(yǎng)皿已事先覆蓋一層poly-L-lysine，繼代培養(yǎng)（passage）的時(shí)候使用trypsin-EDTA（0.05%（w/v） trypsin， 0.5 mM EDTA， pH 7.4）以分散鱟血細(xì)胞。

1.3 ?鱟素萃取

將鱟血細(xì)胞經(jīng)超音破震碎機(jī)震碎后稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，在離心機(jī)上以10300 g離心30分鐘，取其上清液通過(guò)0.22 μm的過(guò)濾膜過(guò)濾后，注入高效液相層析儀（high-performance liquid chromatography）中，以高壓幫浦將A緩沖溶液（20 mmol/l Tris-HCl）與B緩沖溶液（20 mmol/l Tris-HCl，0.5 M NaCl）以0.5 mL/min的流速打入DEAE-Sepharose管柱中，并連接紫外光檢測(cè)器與電化學(xué)檢測(cè)器進(jìn)行鱟素分離與萃取，并收集鱟素測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

取protein assay kit（Bio-Rad， No.500-0006）稀釋5倍，取稀釋液5 mL加入稀釋至適當(dāng)倍數(shù)之血淋巴0.1 mL，在分光亮度計(jì)上以波長(zhǎng)595 nm測(cè)定其吸光值，并以BSA（bovine serum albumin， 66 kDa， Sigma）做為蛋白標(biāo)準(zhǔn)以換算萃取鱟素的蛋白質(zhì)濃度。自HPLC分液收集器收集鱟素后，取鱟素10 μg加入sample buffer （1% SDS，1% 2-mercapto-ethanol， 10 mM pH 6.8 Tris buffer，1% bromophenol blue） 以12.5% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分析，電泳架設(shè)完成后，將膠體通以電流10 mA，20分鐘后再將電流改為15 mA直至bromophenol blue跑出膠體外即切斷電源。將膠體取出后以染色劑（2.5% coomassi brilliant blue溶于50% methanol及10% acetic acid）進(jìn)行染色40分鐘后，以脫色劑 （25% methanol及7% acetic acid）進(jìn)行脫色直至背景顏色消失為止，膠片以電泳膠片掃描機(jī)掃描后分析其分子量以確定收集之蛋白質(zhì)為鱟素。

1.4 ?鱟素抗菌試驗(yàn)

調(diào)配鱟素濃度至0（control）、1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL于含有50 mL NB液態(tài)培養(yǎng)基之錐形瓶中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，分別以轉(zhuǎn)速150 rpm 震蕩培養(yǎng)24小時(shí)及48小時(shí)。培養(yǎng)后將菌液以6， 000 ×g，4℃離心10分鐘，取上清液，隨即進(jìn)行4種病原菌之抑菌實(shí)驗(yàn)，本抑菌試驗(yàn)所用之菌株分別為Vibrio alginolyticus、Aeromonas hydrophila、Photobaterium damselae以及Lactococcus garvieae。

將上述4種病原菌分別接種于鹽度34‰之tryptic soy broth （TSB）液態(tài)培養(yǎng)基，置于27℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24小時(shí)。將病原菌之濃度調(diào)整為109 cfu/mL，取100 μL之菌液，涂盤(pán)于TSA固態(tài)培養(yǎng)基上 （使成每片plate有108 cfu） 各處理組進(jìn)行5重復(fù)分析。經(jīng)24小時(shí)后，測(cè)定細(xì)菌數(shù)并記錄。

所得細(xì)菌活存率以SAS軟件進(jìn)行單因子變異數(shù)分析（one-way ANOVA table），檢驗(yàn)樣本之間是否具有顯著差異，顯著水平設(shè)為p<0.05。

2 ?結(jié)果

鱟血淋巴以HPLC分析后，以分液收集器收集其流洗液，發(fā)現(xiàn)鱟素出現(xiàn)在28-31分鐘之流洗區(qū)段（圖1）。收集流洗液后以SDS-PAGE電泳分析其分子量，確定其分子量約為2.36 kDa，以確定為鱟素（圖2）。

將鱟素進(jìn)行抗菌試驗(yàn)的結(jié)果中，分現(xiàn)在24小的培養(yǎng)后，低濃度鱟素（1 μg/mL、2 μg/mL） 的試驗(yàn)組中﹐各細(xì)菌的活存率在統(tǒng)計(jì)上沒(méi)有顯著的差別（p>0.05）。在5 μg/mL的試驗(yàn)組中，在V. alginolyticus、A. hydrophila、P. damselae以及L. garvieae之活存率分別只有控制組的64.8%、75.3%、57.3%及81.5%。在50 μg/mL之試驗(yàn)組中，經(jīng)果24小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)于V. alginolyticus及P. damselae 之活存率更只剩下5.8及3.2%，明顯低于A. hydrophila及L. garvieae的11.6及18.9% （p<0.05）。因此鱟素對(duì)于本研究所設(shè)定之四種細(xì)菌均有抑菌能力（圖3）。

鱟素對(duì)于V. alginolyticus、A. hydrophila、P. damselae 及L. garvieae之半致死劑量（LD50） 95%置信區(qū)間分別為7.31±1.04 μg/mL、13.26±2.05 μg/mL、6.68±1.13 μg/mL及15.27±2.18 μg/mL。

3 ?討論

鱟有活化石之稱(chēng)，目前全世界的鱟共有四種，分別為中國(guó)鱟（T. tridentatus）、南方鱟（T. gigas）、圓尾鱟（Carcinoscorpius rotundicauda）及美洲鱟（Limulus polyphemus），本研究所使用的中國(guó)鱟主要分布于日本南方沿海及中國(guó)長(zhǎng)江以南，包括浙江、福建、廣東、廣西、海南及臺(tái)灣西部沿海之潮間帶。

鱟之血淋巴細(xì)胞中所含的鱟素（tachyplesin I）是一個(gè)含有17個(gè)胺基酸以及兩個(gè)雙硫鍵的肽，現(xiàn)存的四種鱟中均可發(fā)現(xiàn)。本研究將鱟血淋巴取出后，以高效液相層析儀經(jīng)DEAE-Sepharose管柱分離鱟素，收集28～31分鐘之流洗液，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析后，測(cè)定其主要蛋白質(zhì)之分子量約為2.36 kDa，與其他文獻(xiàn)所提及之鱟素相同，因此本研究所萃取之主要蛋白質(zhì)應(yīng)為鱟素。

近幾年，養(yǎng)殖魚(yú)蝦類(lèi)大量死亡，本研究想要了解鱟素對(duì)于常見(jiàn)水產(chǎn)疾病的病原菌的抑菌作用，弧菌屬的細(xì)菌性疾病是最早被發(fā)現(xiàn)在水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌之一，常見(jiàn)于河口、半淡咸水、海水養(yǎng)殖及野生生物中[9][10]。海水的弧菌種類(lèi)繁多，其中可引起蝦類(lèi)疾病產(chǎn)生的約有6～7種，這些弧菌會(huì)產(chǎn)生大量的外毒素侵襲蝦體，引發(fā)蝦體組織細(xì)胞病變，進(jìn)而引起蝦只急性及慢性死亡。且環(huán)境長(zhǎng)期受到有機(jī)或無(wú)機(jī)物質(zhì)的污染，或病原菌的大幅增長(zhǎng)，這些因素都構(gòu)成蝦類(lèi)病變死亡，且是主要導(dǎo)致養(yǎng)蝦業(yè)經(jīng)營(yíng)困難的原因。

溶藻弧菌Vibrio alginolyticus 最早出現(xiàn)在以色列的鯛類(lèi)（Sparus aurata）養(yǎng)殖中[11]，之后發(fā)現(xiàn)在海水烏魚(yú)（mugil cephalus）的紅斑癥，也會(huì)感染蝦類(lèi)早成細(xì)胞和溶解及肝胰臟周?chē)Y(jié)締組織的空洞化[12]。V. alginolyticus是海洋弧菌中的格蘭氏陰性菌，此一弧菌可能造成在身體末端的傷口感染，不但造成傷口感染，還會(huì)造成軟組織及耳感染。另外，在人身上V. alginolyticus會(huì)引起中耳炎、外耳炎、結(jié)膜炎及傷囗感染，有時(shí)引起敗血癥，在人體有傷口或是免疫力降低時(shí)才會(huì)發(fā)病 [13]。

親水性產(chǎn)氣單孢菌A. hydrophila為革蘭氏陰性桿菌，因具有極性的單鞭毛，使其具有移動(dòng)性，屬于人畜共通病原菌，亦是主要的水生病原菌之一[14][15]。感染魚(yú)類(lèi)后之典型病征為體表及魚(yú)鰭基部潰爛及產(chǎn)生出血性敗血癥、腹水，并造成脾及腎臟等造血組織壞死[16]。

P. damselae屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，生存的棲息地大多數(shù)位于熱帶海洋近海沿海海岸附近，造成海洋動(dòng)物的死亡而且它存在于到處有海洋魚(yú)類(lèi)的環(huán)境中高溫期較易發(fā)生也就會(huì)導(dǎo)致海洋（熱帶）魚(yú)類(lèi)的皮膚潰爛或者有其他多樣化的疾病產(chǎn)生例如腸胃道疾病進(jìn)而導(dǎo)致漁業(yè)經(jīng)濟(jì)上的損失[17]。L. garvieae為鏈球菌的一種，屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，亦是人畜共通菌[18]。L. garvieae 最早由杜氏鰤Seriola dumerili中分離，罹病魚(yú)只會(huì)有體色變暗、凸眼、腹部澎大及眼睛出血的癥狀，在鰓蓋及魚(yú)鰭的基部會(huì)有出血的現(xiàn)象，腹部有積水及出血等癥狀[19][20]。受L. garvieae感染的淡水長(zhǎng)臂大蝦（Macrobrachium rosenbergii），全身肌肉組織呈現(xiàn)會(huì)死病灶[21]。

抑菌肽普遍存在于動(dòng)物和植物中的先天性免疫系統(tǒng)中[22][23]。抑菌肽對(duì)于細(xì)菌的抑菌效果顯著，開(kāi)發(fā)天然抑菌肽對(duì)于細(xì)菌抑制及新藥開(kāi)發(fā)具有相當(dāng)幫助，并且可以大幅度降低對(duì)抗生素的依賴(lài)。結(jié)構(gòu)相連的兩個(gè)雙硫鍵讓鱟素可以在低pH及高溫中仍然可以維持穩(wěn)定[7]，鱟素（tachyplesin I）在細(xì)菌的細(xì)胞膜上形成環(huán)形的孔洞，進(jìn)而造成細(xì)菌死亡[24]。

鱟素濃度50 μg/mL之試驗(yàn)組中，經(jīng)果24小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)于V. alginolyticus及P. damselae之活存率只剩下5.8%及3.2%，顯著低于A. hydrophila、L. garvieae的11.6%及18.9%，此一結(jié)果可發(fā)現(xiàn)鱟素對(duì)于V. alginolyticus及P. damselae之抑菌效果明顯高于A. hydrophila及L. garvieae，此一結(jié)果可能與細(xì)菌之細(xì)胞壁與其細(xì)胞外產(chǎn)物之組成有關(guān)。

本研究中在低濃度的鱟素抑菌實(shí)驗(yàn)組（1 μg/mL及2 μg/mL），在四種細(xì)菌間沒(méi)有顯著的差異，鱟素對(duì)于V. alginolyticus、A. hydrophila、P. damselae及L. garvieae之24小時(shí)之半致死劑量分別為7.31 μg/mL、13.26 μg/mL、6.68 μg/mL及15.27 μg/mL，顯示鱟素對(duì)格蘭氏陰性菌之抑菌效果除產(chǎn)氣單胞菌外較革蘭氏陽(yáng)性菌效果為大，但是其造成原因以及抑菌機(jī)制還需要進(jìn)一步研究闡明。

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